체외에서 FluoroBlok 종양의 침략 분석
Summary
이 비디오는 형광 기반의 방법론을 사용하여 세포 배양 삽입을 통해 세포의 공격을 측정하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
전이성 세포의 특징은 지하 세포막을 통해 공격해서 신체의 다른 부분으로 마이 그 레이션하는 그들의 능력입니다. 세포가 침입하기 위해 지하 막 내려 휴식뿐만 아니라 마이 그 레이션 모두 분비 프로 테아제 수 있어야합니다. BD BioCoat 종양의 침략 시스템은 자신의 침략적 속성의 평가를 허용 조건과 세포를 제공합니다<em> 체외에서</em<sup> 1,2</sup>. 그것은 BD 팰컨 FluoroBlok 24 Multiwell의 균일 BD Matrigel 매트릭스로 코팅되어 8.0 마이크론 기공 크기 PET 막과 함께 삽입 플레이트로 구성되어 있습니다. BD Matrigel 매트릭스의이 유니폼 레이어는 재구성 지하 막 역할<em> 체외에서</em침략을 공부하기 위해 적절한 단백질 구조를 제시하는 동안>은 비침습 세포 진정한 장벽을 제공합니다. 코팅 과정은 세포막을 통해 마이 그 레이션에서 비침습 세포를 차단, 멤브레인의 모공을 occludes. 반대로, 침략 세포로부터 자신을 분리하고 코팅 멤브레인를 통해 마이 그 레이션 할 수 있습니다. 세포 침공의 Quantitation 그러한 DiIC 같은 형광 색소를하거나 사전 또는 사후 세포 침공 라벨에 의해 얻을 수<sub> 12</sub> (3) 또는 calcein은 각각 오전과 침해 세포의 형광을 측정. BD FluoroBlok 막 효과적> 99 % 효율에 490-700 nm의에서 빛의 통로를 차단 때문에, 찬란 – 라벨이 침공하지 않은 전지는 하단 읽기 형광 플레이트 리더에 의해 감지되지 않습니다. 그러나, 멤브레인의 아래쪽에 침공이 세포는 광원으로부터 차폐되지 더 이상하고 각 플레이트 리더로 감지됩니다. 이 비디오는 calcein가 침입 세포를 감지하는 AM 사용하여 엔드 전지 침공 분석을 보여줍니다.
Protocol
BD calcein을 사용하는 포스트 – 라벨링 및 측정은 형광 염료 AM 그들은 BD Matrigel 매트릭스를 통해 침략과 BD FluoroBlok 막 통과 후 세포 quantitation에 대해 표시됩니다. 그 결과, 세포 침공만이 종점 측정 얻을 수 있습니다. ~ 80 %의 합류에 세포를 성장. 준비 및 삽입 시스템을 rehydrate. -20 ° C 저장에서 패키지를 제거하고 실온에 와서 수 있습니다. 호일 패키지를 열고 삽입 우물의 내부 500 μL 따뜻한 (37 ° C) 미디어를 추가할 수 있습니다. 접시, 37에서 2 시간 동안 rehydrate 허용 ° C 5 % CO 2. 참고 :이 uncoated BD 팰컨 FluoroBlok 셀 마이 그 레이션 컨트롤로 사용됩니다 24 Multiwell 삽입 시스템을 rehydrate 필요는 없습니다. rehydration 후, 조심스럽게 멤브레인에 BD Matrigel 매트릭스의 계층을 방해하지 않고 삽입 우물에서 매체를 제거합니다. 시스템은 이제 사용할 준비가되었습니다. 세포 monolayers을 trypsinizing 5 X 10 4 셀 / ML에서 혈청없는 DMEM에있는 세포를 resuspending하여 셀 suspensions를 준비합니다. 참고 : 다른 세포 유형을 사용하는 경우 최적의 시딩 밀도를 결정하기 위해 필요합니다. 다공성 성장 표면에 세포 유형에 대한 최적의 시딩 밀도를 확인하려면, 시딩 밀도의 범위 (셀 / cm 2) 사용하는 브라켓 비유 공성 표면에 사용되는 시딩 밀도 (즉, flasks, 요리 접시). 예를 들어, 사이의 다양한 세포 농도에서 2.5 X 10 5 세포 / cm 2, 씨앗에서 현재 종자 5 X 10 4 5 X 10 5 세포 / cm 2 최적의 초기 시딩 밀도를 결정합니다. 혀끝의 방으로 세포 현탁액 500 μL (2.5 X 10 4 세포)를 추가합니다. 액세스 샘플 포트를 사용하여 기저 방으로 각 chemoattractant의 750 μL (DMEM에 5% FBS)을 추가합니다. BD의 BioCoat 종양의 침략 시스템 및 uncoated BD 팰컨 FluoroBlok 37 ° C, 5 % CO 2 분위기에서 20~22시간 24 – Multiwell 삽입 플레이트를 품어. 부화 후, 신중하게 혀끝의 실에서 매체를 제거합니다. 이것은 폐기물 컨테이너에 내용을 flicking하여 수행할 수 있습니다. 삽입 시스템의 바닥 표면을 만지지 마십시오. 500 μL / 음 4 μg / ML Calcein HBSS에서 AM을 포함한 초 24 – 잘 접시에 삽입 시스템을 전송합니다. 37에서 1 시간 동안 품어 ° C 5 % CO 2. 그것이 cytosolic esterases로 녹색 형광 calcein로 변환됩니다 nonfluorescent 중요한 염료이기 때문에 Calcein AM 솔루션은 형광을 읽기 전에 하부 챔버에서 제거되지 않습니다. 침입 세포의 형광은 하단 읽기 형광 플레이트 리더에 517분의 494 NM (예 / 엠)의 파장에서 읽습니다. 게인 설정은 경험적으로 결정 할 수도 있지만, 미드 이득이 충분 출발점되어야합니다. 너무 높은 이득 설정은 높은 형광 시료와 검출기의 포화로 이어질 수 있으며, 이것은 의미있는 결과의 인수를 방지할 수 있습니다. autogain의 사용 (귀하의 리더에서 지원하는 경우)하지 않는 것이 좋습니다. 거꾸로 형광 현미경은 결과를 확인하는 데 사용할 수 있으며이에게이 분석을 실행 처음 할 특히 유용합니다. 참고 : 그것은 삽입 시스템이 올바른 플레이트지도를 사용하여 읽는 것이 가장 중요합니다. 로딩 플레이트지도에 대한 자세한 내용은 www.bdbiosciences.com 또는 문의 BD 기술 지원 (labware@bd.com)에서 BD 기술 게시판 번호 436을 참조하십시오. 접시가 판독기에 삽입되는 등 적절한 플레이트 방향은 오른쪽으로 방향 왼쪽 상단 모서리와 BD Flacon 로고에 잘 A1이다. 데이터 감소 데이터는 다음과 같은 등식과 같이 표현된다 : 배경 %의 세포 침공의 계산하기 전에 빼서 수 있습니다 RFU = 상대 형광 단위.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BD BioCoat Tumor Invasion System | BD Biosciences | 354165 or 354166 | ||
| HT-1080 and NIH/3T3 cells | ATCC | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free) | ||||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS) | ||||
| BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control | BD Biosciences | 351157 or 351158 | ||
| 5% Fetal Bovine Serum in DMEM | ||||
| BD Calcein AM Fluorescent Dye | BD Biosciences | 354216 or 354217 | ||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | ||||
| BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling | BD Biosciences | 351147 | ||
| Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities | PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar. |
References
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Cite This Article
Partridge, J., Flaherty, P. An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay. J. Vis. Exp. (29), e1475, doi:10.3791/1475 (2009).