Ein In-vitro- FluoroBlok Tumor Invasion Assay
Summary
Dieses Video zeigt, wie man Zellen Invasion durch Zellkultur-Einsätze mit einem Fluoreszenz-basierten Methoden zu messen.
Abstract
Das Markenzeichen von metastatischen Zellen ist ihre Fähigkeit, durch die Basalmembran dringen und wandern in andere Teile des Körpers. Die Zellen müssen in der Lage, sowohl sezernieren Proteasen, die zum Abbau der Basalmembran sowie wandern, um zu invasiv. BD BioCoat Tumor Invasion System bietet Zellen mit Bedingungen, die Bewertung ihrer invasive Eigenschaft erlauben<em> In-vitro-</em<sup> 1,2</sup>. Es besteht aus einem BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Einlegeplatte mit einem 8,0 Mikron Porengröße PET-Membran, die gleichmäßig mit BD Matrigel Matrix beschichtet. Diese einheitliche Schicht von BD Matrigel Matrix dient als rekonstituierte Basalmembran<em> In-vitro-</em> Vermittlung eines den tatsächlichen Hindernis für non-invasive Zellen während der Präsentation eine entsprechende Protein-Struktur, die Invasion zu studieren. Die Beschichtung verschließt die Poren der Membran, blockiert nicht-invasive Zellen aus der Migration durch die Membran. Im Gegensatz dazu sind invasive Zellen in der Lage, sich aus zu lösen und wandern durch die beschichtete Membran. Die Quantifizierung der Zellinvasion kann entweder durch Pre-oder Post-Zell-Invasion Markierung mit einem fluoreszierenden Farbstoff wie DiIC erreicht werden<sub> 12</sub> (3) oder Calcein AM, bzw., und die Messung der Fluoreszenz der eindringenden Zellen. Da die BD FluoroBlok Membran effektiv blockiert den Durchgang von Licht von 490 bis 700 nm bei> 99% Wirkungsgrad, fluoreszenzmarkierte Zellen, die nicht besetzt haben, sind nicht durch einen Boden-reading-Fluoreszenz-Reader erkannt. Allerdings sind Zellen, die an der Unterseite der Membran eingedrungen sind nicht mehr von der Lichtquelle abgeschirmt und sind mit den jeweiligen Platten-Lesegerät erkannt werden. Dieses Video zeigt einen Endpunkt Zellinvasion Assay, mit Calcein AM zu befallenen Zellen zu erkennen.
Protocol
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BD BioCoat Tumor Invasion System | BD Biosciences | 354165 or 354166 | ||
| HT-1080 and NIH/3T3 cells | ATCC | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free) | ||||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS) | ||||
| BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control | BD Biosciences | 351157 or 351158 | ||
| 5% Fetal Bovine Serum in DMEM | ||||
| BD Calcein AM Fluorescent Dye | BD Biosciences | 354216 or 354217 | ||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | ||||
| BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling | BD Biosciences | 351147 | ||
| Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities | PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar. |
References
- Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-ΚB activation. Blood. 109, 2727-2735 (2007).
- Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion. J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).
- Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells. Blood. , 113-2003 (2009).
- Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. e. g. u. e. l. i. n. an Akt Inhibitor, Suppresses IΚBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion. J. Immunol. , 177-5612 (2006).
- Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. , (2005).
- Mannuzza, F., Flaherty, P., Ilsley, S., Kramer, M. An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation. US patent. , (2004).
- Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds. Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).
- Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference. , (2005).
- Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. , (1999).
