組織標的胚キメラ：ゼブラフィッシュの原腸胚細胞移植

パート1：アレクサ594ラベル胚 1.1マイクロインジェクションプレートと針の準備 マイクロインジェクションプレートを作る ウェスター、2007年から技術を用いてアガロース金型内に5つの1 mmの谷には3つで構成される注入プレートを準備します。これらの谷は、ぴったりと効率的かつ体系的microinjectionsの行の胚を開催します。前のプレートを作るために、3つの1 – mmを取る4インチ長い非フィラメント毛細血管と慎重に半分に破る。平らな面に瞬間接着剤、これらの2インチ長い毛細血管、サイドバイサイドの接着剤2つを使用。接着剤第三は、3つの毛細血管のピラミッド形状を作成し、木​​立に囲まれたこの二つの一番上にキャピラリー。乾燥させ、十分な"トラフ型"が構築されるまで繰り返すことができます。 胚の培地に溶解した1.5％アガロースから（5ミリメートルの深さ）20 – 25mLを注ぐ（EM）[5mMの塩化ナトリウム、0.17mMのKCl、0.33mMのCaCl 2、0.33mMのMgSO 4及び0.00003パーセントのメチレンブルー] 100ミリメートルのペトリ皿に。すぐにカビがペトリ皿の底に触れているの平らな面を確保するプレートの底部に以前に作られたピラミッド型トラフの金型の3〜5を配置し、完全にアガロースでカバー。 アガロースが固化したときに、ガラスキャピラリー型を取り出すことが必要があります。削除するには、三キャピラリー型を含む大きなアガロースの正方形を切り取る。ゆっくりとカット角、廃棄の外周に寒天を押しのける。上の正方形の寒天片を反転させると、微細な鉗子を使用して、完全にトラフの金型を削除します。代わりに、新たに成形された井戸を保持するために広場の周りにシャーレに溶融アガロースを注ぐ。設定してみましょう。プレートをパラフィルムでは、4℃で数週間のために密封して保存することができます。寒天内の任意の成長の兆しで捨てる。 microinjectionsのための針。 内部フィラメントでの1mmの必要な注射針のうち、4インチのガラスキャピラリーを行うマイクロピペットキャピラリープラーを使用してください。針が550の熱でFlamming /ブラウンのマイクロピペットプラーを使用して引かれた、120の力、200の速度、および時間/ 200の遅延を引き出します。 1.2胚の回収およびマイクロインジェクション装​​置のセットアップそれらがEMで満たされたペトリ皿に置かれ、維持された後に受精卵がすぐに収集されます。蛍光デキストランの注入は、1細胞段階での理想的であり、16セル第2段階が完了する必要があります。 幅広い先端のガラスピペットを用いて、EMで満たされた室温注入プレートのウェルに胚を除名する。優しく握りしめ鈍鉗子と谷の底部に胚をウェッジその絨毛膜または卵黄危険にさらされている胚は破棄されるべきである。 希薄化後の蛍光Alexa 594解決策の1 – 2μlの（0.2 M塩化カリウムの5重量％）と注射針をロードする。デキストランは、注射針の長さを実行する組み込みフィラメントに起因する毛管作用により注射針の先端に移動することができます。 定位マイクロマニピュレータのキャピラリーホルダーに注射針を取り付けます。 40から50 PSIと500msecのパルス持続時間を開始するインジェクター装置の圧力を調整します。 ゆっくりと鉗子（理想的な直径は0.05〜0.15ミリメートルである）とのシールを破るために注射針の先端をかすめる。 steromicroscopeを使用して、針を校正することの上にミネラルオイルをマイクロメーターの上にデキストランを追放する。エア圧、パルスの持続時間と針先の大きさを調整することによってボーラスサイズを変更します。 0.8 – 1nlの体積に相当するボーラスサイズは、注射3を通じて維持されるべきである。多くの場合、ヒントは、卵黄の粒子が詰まるとなります。圧力を調整したり、針の先端を破ってしまうとそうでない場合は、新しい注射針をロードする必要がある、問題を軽減するかもしれません。 蛍光Alexa 594 1.3 Microinjections 高倍率下では、トラフの一方の端から開始し、スムーズにピアス絨毛膜と胚の細胞膜は、卵黄に入ります。単にセルの下デキストラン溶液を注入。胚を入力するために使用したのと同じスムーズな動きで注射針を除去することを確認してください。次胚をインラインで配置するとトラフの長さを注入し続けるためにペトリ皿を移動します。定期的に圧力とボーラスのサイズを確認してください。これは致命的に胚を損傷および/または注射針を破壊する可能性があるとして、それは胚のときに注射針を移動したり曲げたりしないよう注意してください。 ゆっくりと鉗子と谷の胚を押し出します。抗生物質ペンで満たされたペトリ皿に移す/ EMのようなヌスラインフォルハルト- Volhardとダームで説明されているステップ（2002）（1ミリリットル6.5MのCaCl 2、1ミリリットル3.5M NaHCO 3を 、60mg/mlペニシリンの25ミリリットル20倍EMと10ミリリットル、100mgの/ mlのストレプトマイシンのST後で移植の準備のためにOCK）。 28.5未受精卵または胚の死亡° Cとモニターで胚をインキュベートする。 パート2：原腸期移植 2.1 Dechorionatingと移植プレートの準備 プレートをDechorionating。被包前述した1.5％アガロース溶液を使用して、彼らの卵黄が付着していると前の移植にプラスティック製の一日の消耗しないようにソフトな底板を必要と完了していないDechorionated胚は、5を注いでdechorionatingプレートを作る100ミリメートルのシャーレへの溶融アガロースの-10 mLの。アガロース（2 – 3mm）の唯一の薄層がdechorination中に胚を緩和するために必要です。冷ます。 移植プレート。分離されたウェルの専門プレートは4で説明したように行う必要があります。 100ミリメートルシャーレに1.5％アガロース溶液を30ミリリットル注ぎ、よく金型移植を挿入します。金型は104三角divots 3つの90度の側面で構成される各一45度傾斜面が含まれている必要があります。井戸は2つの胚のside – by – side（図1A、紫色のボックス）を保持するように設計されています。金型の下に気泡をトラップしないように注意してください。アガロース硬化をしましょう​​。金型を削除すると、傾斜したエッジを持つ正方形の井戸を含む沈没した領域を明らかにする。 2.2胚と移植装置のセットアップ ドナーとホスト胚の位置付け ホストとドナーの開発は、年齢をマッチさせたペアリングの近くに維持するために監視する必要があります。これを行うには、胚を遅くしたり、それぞれの開発をスピードアップするために様々な温度（25〜31 ° C）で発生することができます。 両方のホストとドナー胚は前にこれは5hpfまでに完了する必要が原腸期の移植の場合、希望する年齢に寒天でコーティングされたdechorionatingプレート1時間にdechorionated手にする必要があります。 5.5hpfホストとドナー胚では、ステージをシールドする前には抗生物質EMで満たされた移植のプレートにロードされます。胚をガラスピペットを用いて個々に1 mmのウェルにロードされます。例は以下の通りです：最初の行は、ドナー胚で満たされている（18、合計、よく当たり2胚）と次の2行は、ホスト胚（よくごとに胚、行あたり9胚）で埋められます。 移植装置のセットアップ 移植は完全に自動化された、ジョイスティック制御のズームとフォーカスの操作を持っているツァイスLumar蛍光実体顕微鏡で実施されています。移植は、顕微鏡のこの自動化することなく行うことができますが、それは劇的に移植の高い数が所望される場合は特に使いやすさと効率を向上させることはありません。 そのスケールの中央位置にエッペンドルフAirTramを設定します。キャピラリーホルダーへAirTram（図1A、赤のボックス）チューブを接続し、エッペンドルフ自動化されたマイクロマニピュレータ（図1A）にホルダーを固定します。このマニピュレータは、制御された完全に自動化し、ジョイスティックです。再び、この自動化は完全に必要ではないが、かなり周りや胚に注射針をナビゲートするものの能力を向上させます。しかし、我々はAirTramとの難しさを持っていない、あるいは、多くの研究者がセルのコレクションのスムーズな制御を提供すると言われOilTramを好む。 毛細血管使用さ15メートルを持っている滅菌エッペンドルフTransferTips（ES）の先端（図1A緑のボックス）から先端部と20度の曲げ角度1ミリメートルで開いて面取りされた。 2.3原腸期の細胞移植 6hpfで、マイクロマニピュレータを使用すると静かに正中線とシールドが見えるとキャピラリーの先端を反対になるように細胞抽出のための位置に胚を回転させるキャピラリーの先端で胚をかすめる。細胞に損傷を与えるという空気 – 水界面を、接触する細胞の任意のチャンスを防ぐために、キャピラリーへのEMの少量を吸引除去する。 ゼブラフィッシュの運命地図に基づいて、前脳に細胞を標的と正確に動物極とシールド5の間の正中線での細胞の移植を必要とします。静かに穴を開けるこの場所でドナー胚の外胚葉（ローダミンの注入またはGFPトランスジェニック胚）。原腸胚の外胚葉と根底にある卵黄の間に細胞の厚さは薄いですので、これはしばしば時間以内に死亡につながるとして卵黄を突き刺すように注意してください。キャピラリーにゆっくりAirTram吸引細胞を使用する。常に水のラインの可視性を維持する。ドナーの中に先端のわずかな攪拌は、細胞間接触を失うのを助ける。それは胚から削除される前に、ドナー胚から約10から50まで細胞を抽出する必要があります。 ドナー、同様に向きをホストし、ピアスからキャピラリーを削除し、正確なSAに細胞を追放する私宿主胚の動物極とシールドの間に位置。 移植後、ドナーとホスト胚は、ウェルから除去分離し、静かに抗生物質EMで満たされた寒天コーティングしたペトリ皿上に配置されています。移植ウェル中で胚のままにしておくと、死亡率を増加させる。 28.5で胚をインキュベート℃を 2.4可視化とイメージングの胚 固定とライブ胚をマウント。 トランスジェニックGFPまたはローダミン注入胚に由来する宿主胚は生きているかのような固定された胚可視化と画像化することができます。ここでは、両方の固定とライブイメージングのオプションの例を示す。修正の胚は一晩4 C 1を 0.1Mリン酸緩衝液（PB）の4％のparaformadehydeを使用して30hpfに屠殺した。 2倍の胚を洗い流してから0.1M PBで3 × 5分間洗浄します。 我々が提供する例では、固定のホストは、以前に6を説明した（α- AT）アセチル化チューブリンに対する抗体を持つすべての軸索のために免疫標識した。 75％のグリセロールの場所の胚は、4℃で保存し、室温でシンクと℃の two胚をマウントするスライドを準備します。作成する二つワセリンの正方形は、正方形のカバースリップの内側形状と直径に一致するスライドに概説します。 胚をDeyolkと前脳の正面図については、中脳を介して垂直に切断して脳をオフに解剖。よく石油内グリセロールの最小限の量でこの組織を置きます。オリエントは、適切な位置に組織し、試料上にカバースリップを配置。 ライブ試料は、ガラス底の培養皿にTricaineの4％溶液（EMで）で構成された0.75パーセントアガロース溶液にマウントされた。アガロース固化する前に、胚は、イメージングのために正しく配向させるタングステン針とそれを操作されます。カバースリップに対する直接我々の分析のための我々は指向前脳。 イメージング 両方の固定と、ライブのホストはライカSP5レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて画像化した。 Z -スタックは、買収と3れました-または4次元画像処理は、Volocityソフトウェアを使用して完成しました。 結果： 前脳におけるアストログリア細胞の役割に対処するための努力では、これらの細胞を可視化し、間脳と終脳細胞の小さなクラスターに異なる遺伝的操作をターゲットにするの両方に必要です。キメラ胚のこれらのタイプを生成するには、胚内のアストログリアの人口の一部が原腸胚の使用と、遺伝子型または表現型によって、我々はアストログリアにラベルを付けるGFPトランスジェニック胚の使用を組み合わせた多面的なアプローチを、使用されているかどうかは別のもので細胞移植を上演。特に間脳に私たちのクローンを対象とするには、我々は選択的に動物極とシールド5（図1B）から等距離の正中線でセルを抽出するためにゼブラフィッシュ原腸胚の運命地図を利用。これらの抽出されたTG [GFAP：GFP]セルは、その後30hpfに育てられた野生型宿主腸、内の同じ場所に移植し、前脳の解剖学のための基準のランドマークとしてすべての軸索（α-アセチル化チューブリン）のために免疫標識した。ここに示す例として、ひとつのホスト胚の共焦点イメージングは​​、終脳と間脳（図2A）を通じて分離したGFP +細胞を明らかにする。これらのGFP +細胞の完全な形態は、これらの細胞のほとんどは細胞体が脳室帯に隣接し、大端足で放射状のプロセスを終了される特徴的な放射状グリアの形態、をとることを明らかに、このクローン検定で観察することができます。軟膜表面（図2A、挿入図）。これらの収集された光学スライスのZ -スタックの3次元レンダリングは、明確にラベル付け軸索（動画1）に関して、これらの細胞の位置を示した。 一般的に移植された細胞を可視化するために使用される別のアプローチは、最初は1つの細胞の卵黄にそのようなアレクサ594のような蛍光細胞系譜の染料を、、顕微注入するすることです野生型またはGFPトランスジェニック胚を上演した。例として、1細胞期では野生型の胚にアレクサ594を注入した。我々は彼らの盾段階腸胚に発展させ、次いで上記のような前脳標的移植を実施し、その代わりに我々はTG [GFAP：NUC – GFP]に移植したトランスジェニック宿主原腸胚。レーザー走査型共焦点顕微鏡による背側終脳のイメージングは​​GFPの間でドナー細胞の蛍光赤のクラスタ+脳内核（図2B）が明らかになった。我々は、さらにレーザースキャニング共焦点顕微鏡と二時間のコースでZ -スタック3分ごとに収集することによって、このホストを分析した。 Volocityソフトウェアを使用して、このボックスに追加の4次元レンダリング（即興）はローダミンの細胞膜の動的な細胞の動きを示しています。ND GFP +細胞核（動画2）。 図1の拡大バージョンを参照するために彼女をクリックしてください。 図1：実験方法の移植装置と回路図 。 A）装置は、原腸胚段階の移植を実施するために使用。ツァイスLumar蛍光実体顕微鏡は、これらの移植を実施するために使用された。それは、ジョイスティック制御フォーカスとズームを（赤い丸のまま）があります。 Transferman NKは、（右側の赤い丸）制御ジョイスティックであるキャピラリーの位置を操作するために使用された。セットアップ中に60から80までの胚は、以前はプラスチック金型（紫概説ボックス）で100ミリメートルペトリ皿で​​行われた個々の寒天のウェルに配置されます。エッペンドルフ製キャピラリー移植（TransferTip）が 15μmの内径の開口部と20度の角度の先端を（緑の概説ボックス）があります。細胞の吸引は、エッペンドルフのAirTram（赤いアウトラインボックス）で制御されます。宿主の胚にドナーから原腸期移植の手順のB）イラスト。細胞は、TGから抽出されています[GFAP：GFP]胚（ここに示されている）またはAlexa 594注射（プロトコールに記載のように）ドナー胚。細胞は、途中でシールドし、動物極との間の正中線から削除し、宿主胚の同じ領域に移植されています。ホストは、レーザー走査共焦点顕微鏡法を用いて固定し、撮像される。 図2の拡大バージョンをご覧いただくにはこちらをクリックしてください。 図2。ゼブラフィッシュの脳内で原腸期移植の例移植TG [GFAP：GFP]と野生型宿主胚の）正面図。ゼブラフィッシュの脳のdiencephalonsと終脳における細胞。軸索は、赤で表示されています（α-アセチル化チューブリン抗体）と移植された細胞は、緑色（内因性のGFPの発現）にラベルが付いています。胚は30 HPFです。挿入図はGFP +細胞の放射状グリア形態を示しています。ライブTGの終脳のB）背ビュー[GFAP：NUC – GFP]移植された細胞を（赤）蛍光を発するローダミンとホスト胚。宿主胚の核は緑色（GFP）で標識される。破線は前脳の前面の概要を説明します。実線は、脳室帯を示している。スケールバーは、10μmである。 ムービー1。前脳の交連の間で異所的に標識された放射状グリア細胞の関係 TG段階原腸胚から細胞。[GFAPを：GFP]胚は非GFPトランスジェニック野生型のラインに移植した。共焦点Z -スタックを走査レーザーを回収し、Volocityソフトウェアを使用して3 – Dレンダリングのために処理した。最初に、画像は30hpfでゼブラフィッシュの脳の正面図であり、それは、2Bを図に比べて水平方向に反転されています。前交連（AC、上）と後の光交連（POC、底部）内に軸索（-アセチル化チューブリン、赤）が見られる。緑色の細胞はGFP +前脳および生成された明確な放射状グリアの形態で定着した移植細胞です。映画が進むにつれ、それはPOCに連絡して終わり料を有する2本の半径グリア細胞上に焦点を当てています。 動画1をダウンロードするにはここをクリック。 ムービー2。前脳に移植アレクサ594標識細胞のタイムラプスイメージング以前アレクサ594を注入された原腸胚から細胞を Tgに移植した。[GFAP：NUC – GFPトランスジェニック胚。この映画は5分ごとに撮影された、Z -スタックで2Hの時系列、の3次元投影を表します。 Z -スタックレーザー走査型共焦点顕微鏡で収集、および4 – DレンダリングはVolocityソフトウェアを使用して完了。れました移植された細胞は、アレクサ594（赤）で標識し、GFP +細胞核は緑になっていますされています。このボックスに追加が実行されると、4Dの画像は30hpfにおける前脳の背側で始まり、明確な動きはすべて移植された細胞の細胞膜に存在するとGFP +だけでなく、核内に検出されると、X -軸の周りに回転します。 ここをクリックムービー2をダウンロードする。