Tecido alvo quimeras embrionárias: Zebrafish celular Gástrula Transplante

Parte 1: Alexa 594 embriões rotuladas 1,1 Placa de microinjeção e Preparação da agulha Fazer placas microinjeção Prepare placas de injeção composta por 3-5 de 1 mm dentro de um molde de calhas agarose usando uma técnica de Westerfield, 2007 1. Estes vales serão snuggly manter os embriões em uma linha de microinjeções eficiente e sistemática. Antes de fazer as placas, tome três de 1 mm, 4 polegadas de comprimento não-filamentos capilares e cuidadosamente quebrá-las pela metade. Usando superglue, cola dois destes capilares duas polegadas de comprimento lado a lado em uma superfície plana. Cola o terceiro capilar em cima destes dois, situado no bosque, criando uma forma de pirâmide com os capilares três. Deixe secar e repita até que o suficiente "moldes calha" são construídos. Despeje 25 ml de 20 (profundidade de 5mm) de fundição agarose 1,5% em média do embrião (EM) [NaCl 5mM, 0.17mm KCl, CaCl 2 0,33 mm, 0,33 mm MgSO 4 e 0,00003% de metileno blue] em uma placa de Petri de 100mm. Colocar imediatamente 04:57 do anteriormente feito moldes em forma de pirâmide vale para a parte inferior da placa de garantir o lado plano do molde está tocando a parte inferior da placa de Petri e completamente cobertos por agarose. Quando a agarose solidificou, os moldes capilar de vidro deve ser retirado. Para remover, cortar um quadrado grande agarose contendo os três moldes capilar. Suavemente desalojar o agar na periferia da praça de corte e de descarte. Virar a peça agar quadrado mais e, usando uma pinça fina, remova completamente os moldes calha. Despeje de agarose fundida na placa de Petri ao redor da praça para manter os poços recém-moldado no local. Deixar o jogo. Placas podem ser fechados parafilme e armazenados durante semanas a 4 ° C. Devolução ao sinal de qualquer crescimento no agar. Agulhas para microinjeções. Use um extrator micropipeta capilar fazer as agulhas de injeção necessárias de 1 mm, de 4 polegadas capilares de vidro com filamento interno. Agulhas foram retiradas usando o Flamming / Brown Puller micropipeta com um calor de 550, puxe força de 120, velocidade de 200, e um tempo / atraso de 200. 1.2 Collection Embrião e Configuração do Aparelho microinjeção Ovos fertilizados são imediatamente recolhidas depois de serem definidos e mantidos em uma placa de petri preenchida com EM. Injeção de dextranos fluorescente é ideal na fase de uma célula e deve ser concluída até o estágio de 16 células 2. Com uma pipeta de largura gorjeta de copo, expulsar embriões nos poços de uma placa de injeção temperatura ambiente cheio de EM. Suavemente cunha os embriões para o fundo dos vales com clasped fórceps sem corte. Embriões cuja córion ou gema de ter sido comprometida deve ser descartada. Carregar a agulha de injeção com 1-2μl de diluído fluorescente Alexa 594 solução (5% em peso em 0,2 M KCl). Permitir que o dextran viajar para a ponta da agulha de injeção por ação capilar, devido ao filamento incorporados a todo o comprimento da agulha de injeção. Coloque a agulha de injeção para o titular de um micromanipulador capilar estereotáxica. Ajuste a pressão sobre o aparelho microinjetor começar com 40-50 Psi e duração de pulso de 500msec. Suavemente pastar na ponta da agulha de injeção para romper o lacre com uma pinça (diâmetro ideal é de 0,05, 0,15 mm). Usando um steromicroscope, expulsar o dextran em um micrômetro com óleo mineral em cima dela para calibrar a agulha. Modificar o tamanho bolus, ajustando a pressão do ar, duração do pulso e do tamanho da ponta da agulha. Um tamanho bolus equivalente a um volume de 0,8 1nl deve ser mantida durante toda injeções 3. Muitas vezes dicas vão ficar obstruídos com partículas de gema; ajustar a pressão ou quebrar a ponta da agulha pode aliviar o problema, caso contrário, uma agulha nova deve ser carregado. 1,3 microinjeções de fluorescente Alexa 594 Sob alta ampliação, a partir de uma extremidade da calha, sem problemas furar o córion e membrana celular de embriões para entrar na gema. Injectar a solução dextran apenas sob o celular. Certifique-se de remover a agulha de injeção com o mesmo movimento suave usado para introduzir o embrião. Mover a placa de Petri para posicionar a linha embrião próximo e continuar injetando abaixo do comprimento da calha. Verifique a pressão eo tamanho bolus periodicamente. Tenha cuidado para não mover ou dobrar a agulha de injeção quando se está no embrião como é provável que fatalmente danos ao embrião e / ou quebrar a agulha de injeção. Com cuidado, empurre os embriões fora do bebedouros com uma pinça. Transferi-los para uma placa de petri preenchida com caneta antibiótico / Passo EM, conforme descrito no Nüsslein-Volhard e Dahm (2002) (1 ml 6,5 milhões de CaCl 2, 1ml 3.5M NaHCO 3, 25ml e 10ml EM 20x de 60mg/ml penicilina, 100mg / ml st estreptomicinaock), em preparação para o transplante mais tarde. Incubar os embriões de 28,5 ° C e monitor para os ovos não fertilizados ou morte do embrião. Parte 2: O transplante estádio de gástrula 2,1 Dechorionating e Preparação Placa de Transplante Dechorionating placas. Dechorionated embriões que não tenham concluído epiboly exigem uma placa de fundo suave para não ter seus gema aderir e desgaste no dia plastic.The antes de transplantes, utilizando a solução de agarose 1,5% descrito anteriormente, fazer placas dechorionating derramando 5 -10 mL de agarose derretido em uma placa de Petri de 100mm. Apenas uma fina camada de agarose (2-3mm) é necessário para amortecer os embriões durante dechorination. Deixe esfriar. Placas de transplante. Placas Specialized com poços separados precisam ser feitas como descrito em 4. Despeje 30ml de solução de agarose 1,5% em uma placa de Petri de 100mm e inserir um transplante bem molde. O molde deve conter 104 divots triangular cada um composto por três lados 90 graus e um lado de 45 graus ângulo. Os poços são projetados prender dois embriões lado a lado (Fig. 1A, caixa roxa). Tome cuidado para não prender as bolhas de ar sob o molde. Deixe o endurecem agarose. Remover o molde revela uma área submersa contendo os poços quadrados, com uma borda inclinada. 2,2 Embrião e Configuração Aparelho de Transplante Posicionamento de embriões de doadores e de acolhimento Desenvolvimento de hosts e doadores precisam ser monitorados para manter perto da mesma idade emparelhamentos. Para fazer isso, os embriões podem ser levantadas em temperaturas variando (25-31 ° C) para retardar ou acelerar o desenvolvimento, respectivamente. Ambos os host e embriões de doadores deve ser mão dechorionated em um dechorionating placa de ágar revestida uma hora antes da idade desejada No caso dos transplantes de estádio de gástrula isso precisa ser preenchido por 5hpf. Antes de escudo palco, o anfitrião 5.5hpf e embriões de doadores são carregados em um prato cheio de transplante EM antibiótico. Embriões são carregados para o indivíduo 1 mm de poços utilizando uma pipeta de vidro. Um exemplo é a seguinte: a primeira linha é preenchida com embriões doadores (18 total, dois embriões por poço) e as duas seguintes linhas são preenchidas com embriões host (um embrião por poço, 9 embriões por linha). Configurando o aparelho de transplante Transplantes são realizadas no microscópio estéreo Zeiss Lumar fluorescentes que tem totalmente automatizado, zoom joystick controlado e manipulação de foco. Enquanto os transplantes pode ser feito sem essa automação do microscópio que faz aumentar drasticamente a facilidade e eficiência, especialmente quando um grande número de transplantes é desejada. Definir o Airtram Eppendorf para a localização do meio de sua escala. Conectar-se a Airtram tubo (Fig. 1A, caixa vermelha) para o titular capilar, e segura o titular ao micromanipulador automatizado Eppendorf (Fig. 1A). Este micromanipulador é totalmente automatizada e controlada joystick. Mais uma vez, essa automação não é totalmente necessário, mas melhora significativamente as capacidade de navegar em volta da agulha e para o embrião. Alternativamente, muitos pesquisadores preferem o OilTram que é dito para oferecer mais suave controle da coleta de células, no entanto, não tivemos dificuldades com o Airtram. Os capilares utilizados foram esterilizados Eppendorf TransferTips (ES) que têm uma m 15 chanfrado abertura na ponta e um ângulo de 20 graus dobradas uma milímetros da ponta (Fig. 1A caixa verde). Célula 2,3 Gástrula Transplantes Stage No 6hpf, usando o micromanipulador gentilmente pastar o embrião com a ponta do capilar para girar o embrião na posição para a célula extrações tal que a sua linha média e escudo são visíveis e se opondo a ponta do capilar. Aspirar uma pequena quantidade de EM para o capilar para evitar qualquer chance de células em contato com o interface ar-água, que danificam as células. Baseado no mapa o destino zebrafish, tendo como alvo as células para o cérebro anterior exige o transplante de células exatamente na linha média entre o pólo animal eo escudo 5. Suavemente furar o ectoderma de embriões doadores (rodamina injectada ou embriões transgênicos GFP) neste local. A espessura das células entre o ectoderma e gema subjacente na gástrula é fina, por isso, tenha cuidado para não empalar a gema como essa, muitas vezes, levar à morte em poucas horas. Usando as células de aspirado Airtram lentamente no capilar. Sempre manter a visibilidade da linha de água. Leve agitação da ponta, enquanto no doador vai ajudar a perder contatos célula-célula. Cerca de 10-50 células do embrião doador deve ser extraído antes de ser removido do embrião. Remover o capilar do doador, à semelhança orientar o anfitrião, e fure e expulsar as células para a sa exatame localização entre o pólo animal e escudo de embriões host. Após o transplante, os embriões de doadores e de acolhimento são removidos dos poços, separados e delicadamente colocados em um prato de agar petri revestidas preenchido com EM antibiótico. Deixando de embriões nos poços de transplantes aumenta a mortalidade. Embriões incubar a 28,5 ° C. 2,4 Visualizing e embriões de imagem Montagem embriões fixa e ao vivo. Anfitrião embriões derivados de transgênicos GFP ou embriões rodamina injectada pode ser visualizada e fotografada embriões vivos ou como fixo. Apresentamos aqui exemplos de ambas as opções de imagens fixas e ao vivo. Fix embriões foram sacrificados aos 30hpf usando paraformadehyde 4% em tampão fosfato 0,1 M (PB) durante a noite a 4 C 1. Enxágüe embriões 2x e depois lave 3 x 5 minutos em 0,1 M PB. No exemplo que fornecemos, hosts fixos foram immunolabeled para todos os axônios com anticorpos dirigidos contra tubulina acetilados (α-AT), como descrito anteriormente 6. Embriões lugar em glicerol 75%, pia em temperatura ambiente e depois armazenar a 4 ° C. Prepare um slide para montar dois embriões. Criar dois vaselina quadrados contornos em um slide que coincidir com a forma dentro e diâmetro de uma lamela quadrados. Deyolk um embrião e por uma visão frontal do cérebro anterior, dissecar fora do cérebro anterior, cortando perpendicularmente ao longo do mesencéfalo. Coloque este tecido com uma quantidade mínima de glicerol dentro do petróleo também. Orientar o tecido na posição adequada e coloque uma lamínula sobre a amostra. Espécime vivo foram montadas em uma solução de agarose 0,75% confeccionados em uma solução de 4% do tricaina (em EM) em pratos de vidro cultura inferior. Antes da solidificação agarose, o embrião é manipulado com uma agulha de tungstênio para orientar corretamente o para imagem. Para nossa análise, o prosencéfalo orientada diretamente contra a lamela. Imagem Ambos os hosts fixos e viver foram fotografadas usando o Leica SP5 Laser Scanning Microscope Confocal. Z-Pilhas foram adquiridos e 3 – ou 4-dimensional de processamento de imagem foi concluída usando software Volocity. Resultados: Em um esforço para abordar o papel das células astroglial no prosencéfalo é necessário tanto para visualizar essas células e alvo diferentes manipulações genéticas para pequenos aglomerados de células diencefálica e telencefálico. Para gerar esses tipos de embriões quiméricos, em que uma parte da população astroglial dentro do embrião é diferente se pelo genótipo ou fenótipo, usamos uma abordagem multifacetada que combina o uso de embriões transgênicos GFP, que rotula astroglia, com o uso de gástrula -encenado transplante de células. Especificamente para o nosso alvo clones ao diencéfalo, utilizamos o zebrafish mapa gástrula destino para seletivamente extrair células na linha média eqüidistante do pólo animal eo escudo 5 (Figura 1B). Estes extraído tg [GFAP: gfp] células foram então transplantados para o mesmo local em uma selvagem tipo de host gástrula, que era então levantado para 30hpf e immunolabeled para todos os axônios (α-tubulina acetilados) como marcos de referência para a anatomia do cérebro anterior. Como exemplo mostrado aqui imagens, confocal de um embrião hospedeiro revela isolado GFP + células de todo o telencéfalo e diencéfalo (Fig. 2A). A morfologia completa destes + GFP células pode ser observado neste ensaio clonal, revelando que a maioria dessas células assumir a morfologia radial característica glial, onde a soma está situado junto à zona ventricular e um pé grande final termina um processo radial na superfície pial (Fig. 2A, inset). Renderização tridimensional da Z-stack destas fatias coletadas óptica mostrou claramente a posição dessas células em relação ao axônios rotulada (Movie 1). Outra abordagem comumente usados ​​para a visualização de células transplantadas é inicialmente microinject um corante fluorescente linhagem de célula, como Alexa 594, na gema de uma célula de tipo selvagem ou encenado GFP embrião transgênico. Como exemplo, injetadas em embriões Alexa 594 do tipo selvagem na fase de uma célula. Nós lhes permitiu desenvolver para proteger fase gástrula e, em seguida, realizada prosencéfalo transplante alvo como mencionado acima, mas em vez disso, transplantadas para tg [GFAP: nuc-GFP] host transgênicos gástrula. Imagem do telencéfalo dorsal de Laser Scanning microscopia confocal revelou fluorescentes aglomerados de células vermelhas entre doador GFP + núcleos dentro do prosencéfalo (Fig. 2B). Nós ainda analisados ​​este alojamento através da recolha de Z-pilhas a cada três minutos ao longo de duas horas com o Confocal Laser Scanning. 4-dimensional prestação deste timelapse usando software Volocity (Improvisação) mostra dinâmica movimentos celulares das membranas celulares rodamina umnd a GFP + núcleos (Movie 2). Clique dela para ver uma versão maior da figura 1. Figura 1: Aparelho de Transplante e esquemática dos métodos experimentais. Um aparelho) utilizado para realizar estágio gástrula-transplantes. A Zeiss Lumar microscópio estéreo fluorescente foi usado para conduzir essas transplantes. Ele tem controlado o foco joystick e zoom (à esquerda círculo vermelho). O NK TransferMan foi usado para manipular a posição do capilar que é também joystick controlado (círculo vermelho à direita). Durante a configuração 60-80 embriões são colocados em poços individuais agar já fez numa placa de Petri 100mm com um molde de plástico (caixa descritas roxo). O transplante capilar (TransferTip) fabricado pela eppendorf tem uma abertura de diâmetro 15μm interior e uma ponta em ângulo de 20 graus (caixa descritas verde). A aspiração de células é controlada com Airtram Eppendorf (caixa descritas vermelho). B) Ilustração de gástrula procedimento de transplante de doador de estágio em embriões de host. As células são extraídas tg [GFAP: GFP] embriões (mostrado aqui) ou injetado Alexa 594 (conforme descrito no protocolo) embriões de doadores. As células são retiradas da linha média a meio caminho entre o escudo eo pólo animal, e transplantadas para a mesma região de embriões host. Hosts são fixos e fotografada usando Laser Scanning microscopia confocal. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2. Figura 2. Exemplo dos transplantes de estádio de gástrula dentro do cérebro anterior zebrafish A) Uma visão frontal de embriões do tipo selvagem host com transplantadas tg [GFAP: gfp]. Células do diencéfalo e telencéfalo do prosencéfalo zebrafish. Axônios são marcados em vermelho (α-tubulina acetilados de anticorpos) e células transplantadas são rotulados em verde (GFP expressão endógena). Embriões são 30 hpf. O encarte mostra a morfologia da glia radial de células GFP +. B) Vista dorsal do telencéfalo de um viver tg [GFAP: nuc-GFP] embrião hospedeiro com Rodamina fluorescentes células transplantadas (vermelho). Núcleos de embriões de acolhimento são rotulados em verde (GFP). A linha tracejada descreve a superfície anterior do cérebro anterior. Linha sólida indica a zona ventricular. Barra de escala é 10μm. Filme 1. . A relação de ectopicamente rotulados radial células gliais entre comissuras prosencéfalo células a partir de uma gástrula encenado tg [GFAP: GFP] embrião foram transplantadas para um não-transgênica GFP linha de tipo selvagem. A Varredura Confocal a Laser Z-Stack foram coletados e processados ​​por 3 D-renderização usando software Volocity. Inicialmente, a imagem é uma visão frontal do cérebro anterior zebrafish em 30hpf, e tem sido invertida horizontalmente em relação à Figura 2B. Axônios (a-acetilados tubulina, vermelho) dentro da comissura anterior (AC, em cima) e pós-óptica comissura (POC, fundo) são vistos. As células são o verde GFP + células transplantadas que se enraizou no prosencéfalo e gerou morfologia radial glial clara. À medida que o filme avança se concentra em em duas células da glia radial possuindo taxa final que o contato do POC. Clique aqui para baixar Filme 1. Filme 2. Timelapse imagem de transplantados Alexa 594 células marcadas no prosencéfalo células a partir de uma gástrula previamente injetados com Alexa 594 foram transplantadas para tg. [GFAP: nuc-GFP] embriões transgênicos. Este filme representa uma projeção 3-D de um timeseries 2h, em que Z-pilhas foram tomadas a cada 5 minutos. Z-Pilhas foram coletados em um microscópio confocal de varredura a laser, e 4-D renderings concluída utilizando software Volocity. Células transplantadas são rotulados com Alexa 594 (vermelho) e GFP + núcleos são verdes. Como este timelapse é executado, a imagem 4D começa com uma visão dorsal do prosencéfalo em 30hpf e girar sobre o eixo X, como claro movimento é detectado nas membranas celulares de todas as células transplantadas e no GFP + núcleos também. Clique aqui para download Movie 2.