In utero en ex vivo Elektroporatie voor Gene Expression Mouse in retinale ganglioncellen

Deel 1: Voorbereiding voor in utero en ex vivo netvlies electroporations 1. Voor zowel in utero en ex vivo netvlies electroporations Gebruik een elektrode trekker te fijne punt micropipetten voor te bereiden en de tip (of schuine rand van de tip) te breken om een ​​hoekige punt te maken. Bereid DNA-oplossingen om de gewenste concentratie en voeg een kleine hoeveelheid van Fast groene kleurstof (0,05%) tot injecties te visualiseren. Ik adviseer 5 ul DNA-oplossing per moeder in utero netvlies electroporations en 1 ui DNA-oplossing per embryonale kop voor ex vivo netvlies electroporations. Voeg een GFP-expressie-construct (of andere fluorescerend eiwit) om getransfecteerd neuronen te visualiseren. Steriliseer chirurgische instrumenten via autoclaaf. Bereid de ketamine-anesthesie xylazine meng met de volgende verhouding (het maken van ~ 0,2 ml voor elke zwangere vrouw): een 1.0:0.2:4.6 volumetrische verhouding van 100 ug / ml ketamine: 100 ug / ml xylazine: zoutoplossing. Andere anesthetica kunnen worden gebruikt. 2. Want in utero netvlies electroporations alleen Zet de verwarming pad en dek het af met een luier pad. De voorbereiding van de antibiotica-antimycotische oplossing (1:100) in fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) en warm bij verhitting pad. Bereid ~ 2 ml voor elke dam. Plaats steriel gefiltreerd PBS in warm water bad. 3. Voor de ex vivo netvlies electroporations alleen Bereid zuurstof serum vrij medium (SFM) voor de retina incubatie: Bubble 25 ml DMEM/F12 met 95% zuurstof / 5% koolstofdioxide voor ≥ 2 uur. Om de 25 ml zuurstof medium, voeg 0,25 g runder serum albumine (BSA), 250 ul ITS aan te vullen en 50 ul penicilline-streptomycine oplossing. Meng de oplossing voor de BSA dan te ontbinden, steriele filter de oplossing. Deze oplossing moet vers gemaakt voor elke elektroporatie experiment. Bereid SFM + 0,4% methylcellulose medium voor retinal explantatie incubatie: Autoclaaf 0,20 g methylcellulose in een 150 ml fles met een roer magneet. Bereid 50 ml van duurzaam bosbeheer (zoals hierboven, zonder bubbelen), en toe te voegen aan geautoclaveerd methylcellulose fles. Meng deze oplossing bij 4 ° C gedurende de nacht. Steriele filter deze oplossing de volgende dag en bewaar bij 4 ° C, kan deze oplossing worden bewaard voor ~ 1 maand. Op de dag van retinale explantatie oogsten (Deel 5), voor te bereiden gerechten voor retinal explantatie plating: Coat met glazen bodem cultuur gerechten met 250 ul van poly-L-ornithine voor ≥ 2 uur bij 37 ° C. (U kunt ook gerechten kunnen worden bekleed met poly-L-ornithine van de vorige dag en 's nachts geïncubeerd bij 4 ° C) Was gerechten een paar keer met PBS, dan laag gerechten met 200 ul van 10 ug / ml laminine in DMEM/F12 voor ≥ 2 uur bij 37 ° C. Afwassen meerdere malen met PBS bij 37 ° C en laat op PBS tot explantaten zijn klaar voor plating. Voor de rand assays, jas schotels met poly-ornithine als hierboven, dan laag de helft van de schotel met eiwit van belang, samen met een fluorescente marker naar de grens (zoals Alexa Fluor 555 geconjugeerd aan BSA, 1:800) visualiseren gedurende 2 uur bij 37 ° C. Was met PBS, en voeg laminine zoals hierboven beschreven. Deel 2A: In utero netvlies elektroporatie Injecteren en electroporating DNA in E14.5 murine retinae in vivo Injecteer 0,15 ml van de narcose mix intraperitoneale (ip) in een E13.5-E14.5 stage dam. Het duurt 3-7 minuten tot de moeder heeft bereikt een chirurgische vlak van anesthesie. Een volledig onder narcose muis mag niet reageren op beknelling van de achterpoot. Gedurende deze tijd, snijd een klein stukje van de parafilm en pipet ~ 5 ul van de DNA-oplossing op de parafilm. Bend een zuiger (metalen draad) op een 90 ° graden en plaats deze in een getrokken micropippette. Met behulp van de zuiger, zuigen de DNA-oplossing in de micropipet (met behulp van een dissectiemicroscoop kan dit proces hulp). Zodra de moeder heeft bereikt een chirurgische vlak van anesthesie, het gebruik een elektrisch scheerapparaat om een ​​~ 2 inch regio van de buik van de moeder en scheren, en breng vervolgens haar dorsale zijde naar beneden op de verwarming pad. Prep het geschoren gebied door te vegen met een doekje met alcohol, gevolgd door een jodium pad een minimum van twee keer. Breng een druppel oogheelkundig Vet zalf op elk oog om ulceratie van de cornea van de ogen te voorkomen, terwijl de moeder is onder algemene verdoving. Met de pincet, pak de huid en gebruik de schaar om een ​​verticale incisie te maken over de middellijn (~ 1 cm lang) door de huid en spieren van de buik, het blootstellen van het buikvlies. Til het buikvlies met de pincet en een soortgelijke verticale snede door dit membraan naar de buikholte (figuur 1) bloot te leggen. Dan draperen het chirurgische veld met gaasjes aan de buikinhoud te voorkomen contact op te nemen en wordt besmet met de harenvan het dier. Trek de huid en het buikvlies met de tang en gebruik het ontleden spatel om een ​​embryo extract door de incisie (kies de meest toegankelijke embryo). Plaats de spatel tussen de twee embryo's en embryonale voorzichtig de keten te trekken uit de buikholte. Je kunt trekken uit de embryonale ketting met je vingers. * Vanaf dit punt naar voren, houd de embryo's gehydrateerd met steriel PBS * Houd de moeder op de verwarming pad, plaatst haar onder de microscoop ontleden en massage een embryo, zodat het netvlies is naar boven gericht. Ik adviseer te beginnen met een van de meest mediale of laterale embryo, waardoor het makkelijker wordt om bij te houden welke embryo's waren geëlektroporeerd te houden. Neem de micropipet in de dominante hand en het stabiliseren van de embryo met uw andere hand. Met de micropipet, doorboren het netvlies door de baarmoederwand en de vruchtzak. Afhankelijk van de scherpte van de micropipet, kan een behoorlijke hoeveelheid druk om de baarmoederwand dringen te nemen, maar eenmaal door, zal de micropipet betreden het embryo en idealiter het netvlies. Het kan moeilijk zijn te controleren en te peilen naar de diepte van de micropipet zoals het komt in de embryo. Minimaliseren van de hoeveelheid micropipet beweging zodra het het membraan doorboord om te voorkomen dat het vergroten van de entree gat, wat resulteert in het verlies van vruchtwater en embryo dood. Vermijd piercing bloedvaten in de baarmoederwand, omdat dit zal resulteren in bloeden en embryo dood. Zodra u zeker weet dat de micropipet heeft het netvlies ingevoerd, bent u klaar om de DNA-oplossing te verdrijven in het netvlies. Duw langzaam op de zuiger en tegelijkertijd terug te trekken van de micropipet, ervoor te zorgen dat DNA wordt geïnjecteerd door het pad van de micropipet, omdat de micropipet vaak dringt diep aan het netvlies. Als u in het netvlies, te verdrijven 0,5 ui (kan worden gemeten door de 1 ui maatstreepjes op de micropipet) in de extraretinal ruimte tussen de buitenste retina laag en de retinale pigment epitheel (RPE). Je moet in acht groene kleurstof het vullen van de retina en lekt uit in het vruchtwater (figuur 1). De elektroporatie peddels moet worden bewaard in een PBS-gevulde petrischaal tijdens de operatie. Plaats voorzichtig de peddels aan de zijkanten van het embryo hoofd met de positieve (+) paddle aan dezelfde kant als de geïnjecteerde oog. Breng een matige hoeveelheid druk om het hoofd te stabiliseren, maar druk niet op te hard, omdat dit de vruchtzak en resulteren in embryonale sterfte pop. Wanneer de elektroden op hun plaats, leveren vijf 40-V, 50 ms plein pulsen met een frequentie van 60 Hz. Het is niet ongebruikelijk dat de moeder zich samen te trekken als gevolg van de huidige ontsnappen aan de huid en spieren. Herhaal stap 7-9 voor elk embryo zal worden geïnjecteerd en geëlectroporeerd. Ik meestal electroporate 4-8 embryo's per moeder, afhankelijk van de hoeveelheid DNA, het aantal embryo's, toestand van moeder en de hoeveelheid tijd onder narcose. Als alternatief kunnen meerdere embryo's worden geïnjecteerd en vervolgens geëlektroporeerd, in tegenstelling tot injecteren en electroporating elk embryo afzonderlijk. Na electroporating de embryo's, gebruik dan de tang en spatel om de embryonale ketting weer te vervangen in de buikholte. Giet ~ 2 ml van het antibioticum-antimycotische oplossing in de buikholte. Gebruik de hemostaat en een tang om het buikvlies hechtdraad, te beginnen met een dubbele knoop op de voorste gedeelte van de incisie en met een eenvoudige continue hechting patroon in het achterste deel van de incisie te gaan. Gebruik de laatste lus te binden uit de hechtdraad en trim overtollige hechtdraad. Te nieten de incisie gesloten is, lift de huid op het voorste gedeelte van de incisie met stompe tang, let daarbij goed op de huid te scheiden van het buikvlies. Plaats de tanden van de nietmachine rond de huid en druk de nietmachine. Ga verder nieten de incisie gesloten om het achterste einde, die meestal vereist 5-7 nietjes. Veeg de wond rond de nietjes met een alcoholdoekje. Laat de moeder terug op de verwarming pad (duurt meestal tussen de 15 tot 90 minuten voor haar om wakker te worden) en wanneer ze begint te rollen, haar op in een nieuwe kooi buik kant. Om zo weinig mogelijk pijn en ongemak, moeders krijgen buprenorfine (0,05-0,1 mg / kg, sc) bij het ontwaken, en op latere tijdstippen wanneer inschakelen. Om uitdroging te voorkomen, injecteren de moeder met 1,0 ml zoutoplossing subcutaan (sc) ~ 2-4 uur na de operatie, en opnieuw als de avond en de volgende dag indien nodig. 24 uur na de operatie, moet de moeder weer normaal gedrag en zijn drinken en eten regelmatig. Deel 2B: In utero netvlies elektroporatie Het ophalen van geëlektroporeerd netvlies E18.5 Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS, het maken van ~ 5 ml per embryo. Perfusie kan worden gedaan met een zwaartekracht op basis van infusie-systeem of een injectiepomp. (Als alternatief kan E18.5 hoofden eenvoudig worden ondergedompeld in 4% PFA 's nachts.) Injecteren de moeder met0,2 ml van de verdoving mix ip en ervoor zorgen dat zij volledig onder narcose. Gebruik een schaar om de huid en het buikvlies onder de nietjes gesneden om de buikholte en baarmoeder hoornen bloot te leggen. Verwijder een geëlektroporeerd embryo en pin het ventrale zijde naar boven. Knip de buikhuid, peritoneum, diafragma en laterale delen van de borstkas naar het hart bloot te leggen. Pierce van de linker ventrikel met de vlinder naald aan de perfusie setup, en knipte de rechter atrium met een microscissors. Start de perfusie en laat PFA te stromen voor ~ 60 seconden, bloed moet het recht atrium te verlaten en het embryo zou moeten worden bleek als de perfusie succesvol is. Onthoofden het embryo en het verzamelen van het hoofd in 4% PFA in 15-ml conische flacon. Herhaal deze procedure voor alle geëlektroporeerd embryo's. Houden hoofden in 4% PFA overnacht bij 4 ° C, en daarna wassen in PBS voor meerdere dagen. Euthanaseren moeder via cervicale dislocatie als alle embryo's worden verzameld. Het verwijderen van het netvlies Na de PBS wast, pin het hoofd in een dissectie schotel met het netvlies naar boven en onder te dompelen in PBS. Verwijder het vel van rond het netvlies van de RPE te onthullen. Met behulp van een 26G1 / 2 naald, prik de ventrale netvlies bij de lens-RPE kruising. Plaats een rand van een microscissors in dit gat en maak een verticale insnijding door de ventrale netvlies naar de optische schijf. Deze kunt u te oriënteren het netvlies wanneer u verwijderen. Verwijder de RPE met fijne punt tang. Pak de RPE bij de ventrale incisie met een pincet en het gebruik van andere tang te pellen van de RPE uit de buurt van het netvlies, specifiek op de RPE-lens kruising waar de RPE goed vastzit. Na het verwijderen van de RPE, pak de lens met fijn pincet en trek omhoog en weg om de lens te verwijderen. Verwijder netvlies door het plaatsen van een tang rond oogzenuwkop en knijp af netvlies. Overdracht netvlies naar een PBS-gevulde goed, het bijhouden van die retinae kwam uit die aan het hoofd. Herhaal stappen 4-5 voor de contralaterale netvlies, en voor alle andere geëlektroporeerd embryo's. De niet-gespoten netvlies dient als een controle voor immunokleuring. Gebruik een fluorescerende dissectiemicroscoop alle retinae scannen op GFP + cellen (groen retinae). Voor alle GFP + retinae, de elektroporatie was succesvol in deze embryo, en deze retinae en de bijbehorende hersenen (met het visuele systeem intact) kunnen worden verwerkt voor verdere analyse (dat wil zeggen het snijden en immunokleuring) (Figuur 1). Deel 3a: Ex vivo netvlies elektroporatie Injecteren en electroporating DNA in E14.5 murine retinae in vitro Verdoven een E13.5-E14.5 stage moeder met 0,2 ml van de narcose mix en ervoor te zorgen dat zij volledig onder narcose. Gebruik een schaar te snijden door de huid en de buikholte om embryo's bloot te leggen. Til embryonale ketting met een pincet en dwars door bindweefsel om hele embryonale keten volledig te verwijderen van de moeder. Plaats embryonale ketting in een petrischaal met DMEM/F12 op het ijs. Euthanaseren moeder via cervicale dislocatie. Snijden door het hele baarmoederwand met een microscissors. Maak dan gebruik van een tang om elk embryo te verwijderen uit de vruchtzak en knijp uit placenta. Onthoofden ieder embryo en verzamel hoofden in een andere petrischaal met DMEM/F12 op het ijs. Met behulp van de mond pipet of plunjer pipet, vul micropipet met de gewenste hoeveelheid DNA-oplossing (zie deel 1). In dit protocol, zal DNA worden geïnjecteerd in de perifere dorsale netvlies. Men kan richten andere retinale regio's, door het aanpassen van de DNA-injectie en de positionering van de elektrode peddels. Overdracht ene hoofd naar het ontleden van gerecht met PBS en speld het hoofd dorsale zijde naar boven. Gebruik een tang om huid te verwijderen boven netvlies. Houd de micropipet ~ 10 ° van de horizontale positie (in wezen parallel aan de kromming van de rug-netvlies), micropipet drukken door middel van de RPE, zodat de tip is tussen het RPE en de buitenste laag netvlies. Verdrijven ~ 0.1-0.4 ul DNA-oplossing in deze ruimte, groene vloeistof moet worden waarneembaar vullen hele ruimte en lekt door het gat in RPE. Herhaal injectie voor de contralaterale netvlies. Voorzichtig maar al snel verwijder de pennen en (het houden van het hoofd ondergedompeld in PBS) plaats elektrode paddles rond het hoofd, met de positieve (+) paddle aan de ventrale zijde van het hoofd. Lever vier 40-V, 50 ms pulsen bij 60 Hz, dan terug plaats het hoofd in een schotel met DMEM/F12 op ijs (figuur 2). Herhaal stap 5-7 voor alle hoofden en voor alle DNA-oplossingen. Na het voltooien van electroporations, voeg ~ 1,5 ml van zuurstofrijk SFM oplossing voor een 4-goed gerecht en blijf op ijs (een goed voor elk verschillend geïnjecteerde DNA-oplossing). Overdracht het ene hoofd naar een ontleden schotel met DMEM/F12, met een netvlies naar boven. Op ventrale netvlies (of zijde tegenover doelgebied), gebruik fijne tang om te knijpenen scheur een gat in de RPE. Steek een uiteinde van de tang door dit gat te pellen van de RPE uit de buurt van het netvlies, specifiek op de lens-netvlies kruising. Niet knipt of schade aan het netvlies, omdat dit zal leiden tot netvlies op zichzelf instorten tijdens de incubatie. Na het verwijderen van RPE, een tang om pop out netvlies door te knijpen oogzenuw aan de basis van het netvlies (laat de lens intact). Overdracht retinae naar zuurstofrijk SFM. Flip hoofd over en herhaal voor de contralaterale oog. Compleet stap 9 voor alle geëlektroporeerd hoofden. Incubeer netvlies in zuurstofrijk duurzaam bosbeheer op 37 ° C gedurende 40-48 uur. Deel 3b: Ex vivo netvlies elektroporatie Oogst en plating van GFP + netvlies explantaten (2 dagen na elektroporatie) Breng alle retinae uit een put van zuurstofrijk SFM in een petrischaal met deksel DMEM/F12. Selecteer een netvlies en het gebruik fluorescerende ontleden ruimte om GFP + (groen) deel van de retina te visualiseren. Met behulp van een microscalpel en tang, ontleden en gooi het niet-GFP + gedeelte van het netvlies, zodat alleen een GFP + stuk van het netvlies blijft. Het is nuttig om voortdurend tussen de TL-en reguliere lichtschakelaar in de dissectie specifiek selecteer de GFP + netvlies. Breng de GFP + netvlies om een ​​goed met DMEM/F12. Herhaal stap 2 voor alle netvlies van een goed. Voor elke DNA conditie (elk ander goed), gebruik een nieuwe petrischaal en DMEM/F12 medium. Deze GFP + retinae moet nu worden ontleed in kleinere netvlies explantaten voor plating. Onder een ontleding bereik, snijd groot stuk van GFP + netvlies in kleinere explantaten met een microscalpel. Explanten moet rechthoekig, ~ 200 tot 300 micrometer in lengte en breedte. Verzamel alle explantaten in een put met DMEM/F12. Een GFP + stuk van het netvlies moet produceren ~ 40-10 GFP + netvlies explantaten afhankelijk van de grootte van weefsel. Herhaal deze stap voor alle GFP + netvlies regio's die werden geoogst. Na het voorbereiden van alle GFP + netvlies explantaten, voeg 250 ul van SFM + 0,4% methylcellulose (bewaard op 4 ° C) om laminine-coated cultuur gerechten (zie Deel 1). Transfer 4-8 GFP + explantaten aan de cultuur schotel en gebruik de tang om voorzichtig de explantaten schikken in een veelhoek, met explantaten ligt halverwege tussen het centrum en de rand van de schotel. Bepaal welke kant van de Explantatie is het RGC laag. Soms RPE kristallen blijft vastzitten aan het buitenste retina laag, wat aangeeft dat de andere kant is het RGC laag. Daarnaast heeft de RGC zijkant heeft meestal een aantal cellulaire puin dat kan helpen bij de juiste explantaat oriëntatie. Met het RGC laag naar beneden, een tang om stevig drukken het centrum van de explantatie zodat het zich houden aan de glazen dekglaasje aan. Een inkeping in de explantatie van de tang kan zichtbaar zijn, dit is normaal. Na plating alle explantaten op een cultuur schotel, over te dragen aan een 37 ° C incubator. Retinale axonen zijn voor het eerst waargenomen 4-6 uur na plating en explantaten gezond te blijven gedurende enkele dagen, maar significante overgroei kan optreden na 24 uur. Explanten kan worden gebruikt voor tal van in vitro testen, gefixeerd met 4% PFA gedurende 30 minuten en immunostained (figuur 2). Border Assay Alternatief: breng 4 GFP + explantaten om een ​​gerecht dat is opgesteld voor de grens-test (zie Deel 1). Schik de explantaten in een verticale lijn in het midden van de schotel, onderlinge aanpassing van de ligging van de grens. Onder een tl-dissectiemicroscoop, het bord van de explantaten zodat ze ~ 50-150 mm van de tl-grens. Incubeer gerechten bij 37 ° C gedurende 24 uur, waardoor ruim de tijd voor het RGC axonen naar grens substraat te bereiken. Explanten kan worden vastgesteld in 4% PFA gedurende 30 minuten, gevolgd door immunokleuring (figuur 2). Representatieve resultaten