デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応による精製ベクターサンプル中のアデノ随伴ウイルスゲノムの定量(英語)

ここで説明するプロトコールは、導入遺伝子12 として緑色蛍光タンパク質(GFP)を含む精製された自社製AAV9ベクターのウイルスゲノム力価を高い精度で定量するように設計されています(表1)。ただし、このプロトコルは、プライマー/プローブセットが目的の特定のベクターゲノムを標的とするように設計されている場合、任意のAAV血清型および任意のベクターゲノム設計に適用できます。この研究で使用した試薬、プライマー、プローブ、および機器の詳細は、 材料表に記載されています。 1. 原液の調製 注:外来DNAによる汚染を避けるために、PCRワークステーションでサンプル希釈に必要なすべてのストック溶液を調製してください。 500 mMのKCl、100 mMのTris-HCl、15 mMのMgCl2 、および0.01 %(w/v)BSAからなる10x PCRアッセイバッファーを調製します。溶液のpHを測定し、8.3に調整します。注:この溶液は、室温で最大1か月間保存できます。 1x PCR assay buffer、0.2 ng/μL salmon sperm sheared (sss) DNA、および 0.1 % pluronic F-68 からなる AAV 希釈バッファーを調製します。この溶液は各アッセイで新たに調製し、4°Cに保ちます。注:プルロン酸F-68が利用できない場合は、Poloxamer 188非イオン性界面活性剤などの代替品を使用できます。 2. サンプルの調製 – DNase I処理と段階希釈 注:ベクターゲノム滴定の精度を低下させる可能性のあるDNA汚染物質を除去するために、AAVサンプル内に存在する遊離DNA(残りのプラスミドDNAまたはカプセル化されていないウイルスゲノムを含む)を、DNaseを使用してPCR増幅する前に除去することができます。これが可能なのは、ベクターゲノムがAAVキャプシド内にカプセル化されているため、PCR反応自体の変性ステップまでアクセスできないためです(ステップ5を参照)。また、どのサンプルのベクターゲノム番号も不明なため、検出可能な上限と下限の範囲内に収まるように、サンプルを段階希釈する必要があります。すべてのサンプル操作はPCRワークステーションで行います。特に指定がない限り、すべてのサンプルを氷の上に置いてください。 分析用に選択したAAVサンプルを短時間ボルテックスして混合し、次に遠心分離して、サンプルを含むチューブの底にすべての液体が残るようにします。 DNase処理では、DNaseフリー水に1x DNase Iバッファー、0.1%プルロン酸F-68、および0.04 U/μL DNase Iを含む溶液45 μLを0.2 mL PCR 8チューブストリップチューブに加えます。 5 μLのサンプルをDNAse溶液の入ったチューブに移します。サンプルをボルテックスし、短時間遠心分離して、すべての液体が底に残るようにします。 サーモサイクラーで、サンプルを37°Cで1時間インキュベートした後、4°Cまで冷却します。 4°Cに達したらできるだけ早く氷の上に置きます。 新しい0.2 mL PCR 8チューブストリップを使用して、DNase処理したサンプルをAAV希釈バッファーで適切に希釈します。推奨されるサンプル希釈は、予想されるvg力価によって異なりますが(表2)、サンプルごとに少なくとも2つの異なる希釈を目指し、各希釈を重複して実行します。ボリュームを取り出す前に、サンプルを厳密に(2,000〜3,000 rpm)5秒間ボルテックスしてください。 段階希釈後、サンプルをボルテックスして遠心分離し、すべての液体がチューブの底に残っていることを確認します。 vg力価が既知であるポジティブコントロールと、テンプレートなしコントロール(NTC)とも呼ばれるネガティブコントロール(AAV希釈バッファーのみ)が含まれます。注:ポジティブコントロールは、プライマー/プローブの標的配列を含む、自社製のAAVまたは市販のAAV標準物質にすることができます。 3. マスターミックスdd_PCR調製 注:ベクターゲノム内の適切な標的配列を選択し、公開されたガイドライン13に従ってFAMまたはHEXレポーター蛍光色素で標識されたフォワードプライマー、リバースプライマー、および加水分解プローブを設計します。導入遺伝子はベクターゲノムデザインに特異的であり、ITRのヘアピン形成に関連する二次構造が効率的なプライマー結合を妨げる可能性があるため、ITRを標的とするプライマーよりも導入遺伝子を標的とするプライマーが好まれます。さらに、ITRプライマーは、切断されたベクターゲノム断片を含む部分的に充填されたカプシドが存在し、ITR配列のいずれかをまだ保持している場合、AAV力価を過大評価する可能性があります14。dd_PCRマスターミックスを専用の独立したワークステーション(PCR前室)で調製します。この部屋は、相互汚染を避けるために、サンプルが準備される部屋とは分離する必要があります。 プライマー、プローブ、およびdd_PCRスーパーミックス試薬を室温(20〜25°C)まで待ちます。その後、すべての試薬をボルテックスし、チューブを短時間遠心分離して、チューブの底にすべての液体を収集します。 表 3 に記載されている容量と濃度に従って、フォワードプライマーとリバースプライマー、プローブ、dd_PCRスーパーミックス、および DNase-free 水を組み合わせて、必要な反応数に応じて、別のマイクロ遠心チューブに dd_PCR マスターミックスの量を調製します。マスターミックスをボルテックスし、チューブを短時間遠心分離して、すべての液体がチューブの底に残っていることを確認します。注:ピペッティング容量の損失を考慮するために、常に必要量(n + 1)よりも余分なdd_PCRマスターミックス容量を準備してください。 19.8 μLのマスターミックスを、新鮮な0.2 mL PCR 8チューブストリップ上の各チューブに移します。 4.液滴の生成 注:サンプルとdd_PCRマスターミックスは、液滴発生カートリッジにロードする前に別々に混合されます。アンプリコンの汚染を避けるために、PCRワークステーション、できればサンプルが調製された場所とは異なるPCRワークステーションですべての操作を実行します。または、サンプルを調製した後、PCRワークステーションを完全に洗浄します。 希釈したサンプル2.2 μLを、PCR 8チューブストリップの各チューブ内の19.8 μLの容量のdd_PCRマスターミックスに移し、よく混合します。ボルテックスし、短時間遠心分離して、すべての液体が底に留まるようにします。 この溶液20μLを、液滴発生カートリッジの中央の「サンプル」列に含まれるウェルに移します。液滴発生カートリッジ内の気泡を避けてください。これにより、機器がエラーを発し、液滴の生成に失敗する可能性があります。注:カートリッジはPCRチューブストリップと同様に8ウェル形式であるため、8チャンネルピペットを使用することをお勧めします。 液滴発生カートリッジの下部の「油」列に含まれるウェルに60μLの液滴発生油を移します。注意: 液滴発生カートリッジのウェルを空のままにしないでください。空のサンプルウェルにプローブ用のdd_PCRバッファーコントロールを充填します(上記の対応する容量を使用)。 液滴発生カートリッジにゴム製のガスケットをかぶせ、液滴発生器に入れます。 液滴が生成されたら、8チャンネルピペットを使用して、dd_PCRチップから42.5μL溶液をマルチウェルPCRプレートにゆっくりと移します。注:ピペッティング中に液体中の液滴がせん断しないように、ゆっくりと45度の角度でピペットします。プレートを目視検査して、すべてのウェルに同じ量の液体が充填され、液滴がウェル内の不透明な層として見えるようにします。 ヒートシール機のアルミホイルカバーでプレートを180°Cで5秒間シールします。注:すべてのウェルが密封されていることを目視で確認します。そうでない場合は、180°Cでさらに5秒繰り返します。 密閉されたプレートは、サーマルサイクラーでdd_PCR増幅する前に、4°Cで最大4時間保持できます。 5. dd_PCR増幅 注:サーマルサイクラーは、PCR前の活動をPCR増幅から空間的に分離し、アンプリコン汚染による偽陽性の結果を避けるために、PCR前の部屋とは別の部屋に配置する必要があります。 プレートをサーマルサイクラー(96ディープウェル反応モジュール付き)に置き、PCR増幅を行い、しっかりと閉じます。 表4に記載されている条件で、反応量40 μLで動作するようにサーモサイクラーを設定します。プログラム設定に予熱ステップを含め、蓋が99°Cに加熱されていることを確認します。 PCRプログラムが終了したら、プレートを4°Cに少なくとも15分間保持して、プレートが完全に冷却されていることを確認します。注:プレートは、液滴を読み取る前に4°Cで48〜72時間保持できます。 6.液滴の読み取り プレートを液滴リーダーにセットし、システムソフトウェアに次の情報を入力して、読み取りを続けます。注:実験タイプ=直接定量;Supermix = プローブのdd_PCRスーパーミックス(dUTPなし)。アッセイタイプ = チャネルごとに 1 つのターゲット。ターゲット情報、信号チャネル1 = FAMチャネルまたはHEXチャネルは、使用するプローブによって異なります。 サンプルに注釈を付けて、各サンプルの位置をデータファイルから効果的に特定できるようにします。 7. データ分析 液滴リーダーの製造元が提供する互換性のあるソフトウェアを使用してデータ分析を実施します。 システム適合性試験を実施して、アッセイの全体的な性能(したがって信頼性)を評価します。PCRプレート上の各ウェルについて測定されたイベントカウント(液滴数)を確認します。イベント数は 15,000 から 20,000 の間が理想的です。イベント数が <10,000 の場合、この値は分析から除外する必要があります。 1Dまたは2Dの振幅プロットを評価し、液滴の雨の存在を確認します。 [データ テーブル] タブに移動し、データを Excel ファイルにエクスポートします。 以下の手順に従ってvg力価を計算します。dd_PCRの作業範囲は10-10,000コピー/μLで、<10コピー/μLの値を分析から除外します。ここで使用するdd_PCR機器の推奨範囲は、25〜5000コピー/μLです。注:データ解析ソフトウェアは、PCR反応量(40μL)に応じたベクターゲノム番号を提供しますが、これはサンプル調製中に適用される希釈係数を考慮していません。 以下の関係を使用して、サンプル調製全体のさまざまな希釈係数を考慮に入れることにより、容量あたりのサンプルvg力価(通常はvg/mLで表されます)を計算します。注:濃度(データ解析から得られた値)×10(DNase I処理前希釈)×10(PCRマスターミックス希釈)×1000(μL〜mL)選択したサンプル希釈(AAV希釈バッファー内 – 表2など)。 反復間および同じサンプルの異なる希釈間の変動係数(%CV)を計算します。注:%CVは、標準偏差を平均で割って計算されます。異なる希釈間の%CVが>20%の場合、その値は正確であると見なすべきではありません。 ネガティブコントロールとポジティブコントロールの値を確認します。ネガティブコントロールは5コピー/μL未満である必要があります。