La quantification précise des copies du génome du vecteur du virus adéno-associé (AAV) est essentielle, mais un protocole standardisé n’a pas encore été établi. Ce protocole décrit une méthode validée pour la préparation d’échantillons d’AAV purifiés et la réalisation d’une réaction en chaîne par polymérase (dd_PCR) numérique en gouttelettes afin de quantifier de manière fiable le titre du génome viral.
Le virus adéno-associé (AAV) est un virus non pathogène utilisé comme véhicule d’administration pour transférer des gènes thérapeutiques chez les patients. La quantification précise du nombre de copies du génome AAV dans les préparations de vecteurs est essentielle pour l’optimisation des bioprocédés et le calcul du dosage dans les études précliniques et cliniques de produits de thérapie génique à base d’AAV. À l’heure actuelle, il n’existe pas de protocole consensuel pour le titrage du génome viral AAV. Ici, nous présentons un protocole de PCR numérique par gouttelettes (dd_PCR) pour la quantification des génomes viraux dans des échantillons de vecteurs purifiés. Les échantillons sont traités avec de la DNase I pour éliminer l’ADN contaminant non emballé. Les échantillons traités à la DNase sont ensuite mélangés avec un ensemble d’amorces-sondes appropriées (conçues en fonction du génome AAV cible) et des réactifs PCR, puis chargés dans un générateur de gouttelettes. Les gouttelettes préparées sont transférées dans une plaque PCR, où l’amplification de la PCR est effectuée et analysée. Le titre du génome viral est calculé en fonction de la concentration (copies/μL), en tenant compte des dilutions de l’échantillon. Une mesure réussie montre une séparation claire des nuages de gouttelettes positives et négatives, a au moins 10 000 gouttelettes acceptées, montre une valeur comprise entre 10 copies/μL et 10 000 copies/μL, et a un coefficient de variation (CV) entre les répétitions inférieur à 20%. Un titrage fiable du génome viral contribuera au développement de produits de thérapie génique sûrs et efficaces à base d’AAV.
La thérapie génique est une modalité thérapeutique couramment utilisée pour traiter les troubles génétiques. La conception d’une thérapie génique donnée est spécifique à la pathologie associée à l’indication cible, mais toutes les thérapies géniques impliquent l’administration intracellulaire de matériel génétique aux cellules cibles afin de provoquer un effet thérapeutique1. La thérapie génique peut être classée en plusieurs catégories, notamment le remplacement de gènes pour les mutations de perte de fonction, le silençage génique pour les anomalies de gain de fonction et les techniques d’édition de gènes. Quelle que soit la stratégie spécifique employée, le matériel d’acide nucléique thérapeutique (appelé transgène) doit être emballé dans un vecteur afin d’obtenir une administration intracellulaire ciblée2.
Bien qu’une variété de systèmes de vecteurs viraux et non viraux soient disponibles pour le développement de la thérapie génique, les virus adéno-associés (AAV) sont fréquemment choisis en raison du large tropisme viral et de la faible immunogénicité associés à ce groupe de virus 1,2. À ce jour, sept thérapies géniques utilisant l’AAV pour l’administration thérapeutique de gènes ont obtenu l’approbation de l’Agence européenne des médicaments (EMA) ou de la Food and Drug Administration (FDA) ciblant des maladies allant de l’hémophilie (par exemple, le Roctavian) à l’amyotrophie spinale (par exemple, Zolgensma)3.
La production de thérapies géniques à base d’AAV découle d’une compréhension de l’AAV de type sauvage lui-même. L’AAV est un petit virus à ADN de la famille des Parvoviridae comprenant 13 sérotypes principaux (AAV1-13)3. Le génome de l’AAV comprend une molécule d’ADN simple brin de ~4,7 kb contenant deux cadres de lecture ouverts principaux (ORF) qui codent pour les gènes viraux essentiels nécessaires à la réplication du génome, à l’assemblage de la capside et à l’empaquetage (rep, cap). Le génome viral est flanqué aux extrémités 5′ et 3′ de séquences nucléotidiques palindromiques, appelées répétitions terminales inversées (ITR). Ces ITR forment des structures en forme d’épingle à cheveux qui jouent un rôle crucial dans la réplication du génome et l’empaquetage des génomes viraux de novo dans des capsides virales nouvellement synthétisées. L’AAV est un virus dépendant de l’aide et, par conséquent, nécessite l’expression de gènes auxiliaires d’autres virus, tels que le virus de l’herpès simplex (HSV) ou l’adénovirus (AdV) afin de devenir compétent en matière de réplication1.
Afin de produire des AAV, un système d’expression cellulaire approprié est utilisé pour faciliter l’expression des protéines de la capside virale et l’assemblage ultérieur en particules virales de novo, suivi de l’encapsidation d’un transgène sélectionné flanqué d’ITR (également appelé génome vecteur). Ce processus utilise généralement un système plasmidique triple, comprenant (1) un plasmide hébergeant des gènes auxiliaires dérivés d’un virus auxiliaire, (2) un plasmide codant pour les éléments viraux essentiels (rep/cap), et (3) un plasmide portant la cassette d’expression thérapeutique (communément appelé plasmide de transfert)4. La présence unique de signaux d’empaquetage à répétition terminale inversée (ITR) flanquant la cassette d’expression thérapeutique dans le plasmide de transfert assure un empaquetage spécifique du transgène, tout en excluant la plupart du temps les gènes viraux présents sur les autres plasmides. La co-transfection de ce système à trois plasmides dans une plateforme d’expression cellulaire (généralement HEK293T cellules) entraîne la production de particules virales compétentes en transduction et déficientes en réplication, adaptées à une utilisation dans des applications de thérapie génique 3,4.
Il existe un certain nombre d’attributs de qualité critiques (AQC) associés à la production de thérapies géniques à base d’AAV qui doivent être évalués afin de garantir l’activité, la pureté et l’innocuité du produit médicinal prévu4. Ces CQA incluent le titre de virus, la teneur en capside et l’agrégation. Le titre viral lui-même est une combinaison du nombre de particules virales (titre de capside) et du nombre de génomes de vecteurs (titre de génome de vecteur) présents dans une préparation donnée. Idéalement, le rapport entre ces deux titres devrait être de 1:1 puisque chaque particule virale devrait contenir un génome de vecteur, mais les inefficacités dans l’emballage du génome du vecteur pendant la biosynthèse entraînent la coproduction de capsides vides ou partiellement remplies (celles contenant des séquences partielles du génome du vecteur et/ou des séquences du génome non vectoriel)5. La présence de telles impuretés peut potentiellement provoquer des réponses immunitaires injustifiées et entrer en compétition pour les sites de liaison aux vecteurs, augmentant ainsi le risque d’immunotoxicité et réduisant le taux de transduction des capsides pleines6. Une quantification précise des génomes des AAV est donc essentielle pour établir le titre du virus et la teneur en capside. Cela a un impact à la fois sur la recherche fondamentale et sur l’industrie de la thérapie génique, qui nécessite un dosage précis afin de maintenir à la fois l’innocuité et l’efficacité des médicaments.
La réaction en chaîne par polymérase (dd_PCR) des gouttelettes numériques est devenue étroitement associée à la quantification du titre du virus, car elle peut être utilisée pour déterminer le nombre de génomes de vecteurs présents dans une préparation donnée7. La PCR numérique elle-même a été introduite pour la première fois dans les années 1990 8,9 et dd_PCR est une amélioration de cette technologie qui permet le traitement d’échantillons à haut débit10,11. En dd_PCR, une réaction de PCR en temps réel de 20 μL est divisée en environ 20 000 gouttelettes enrobées d’huile, ce qui donne jusqu’à 96 réactions de ce type lorsqu’elle est logée sur une plaque standard à 96 puits. Par rapport à la PCR quantitative conventionnelle (qPCR), dd_PCR offre plusieurs avantages, notamment une sensibilité accrue, une précision accrue et une quantification plus directe et absolue des séquences cibles sans avoir besoin de courbes standard. De plus, le niveau élevé de répartition dans dd_PCR réduit l’impact des inhibiteurs de PCR et minimise le potentiel de biais dû à l’amplification préférentielle de certains matrices, ce qui en fait une option attrayante pour la mesure analytique du titrage du génome vectoriel.
La quantification précise des copies du génome des vecteurs AAV dans les préparations de vecteurs est essentielle pour le développement de produits de thérapie génique à base d’AAV. Il existe plusieurs méthodes pour déterminer le titre vg, la PCR quantitative (qPCR) et la dd_PCR étant les deux techniques les plus utilisées et les plus acceptées. dd_PCR est souvent préférée à la qPCR en raison de son indépendance vis-à-vis de l’efficacité de l’amplification, de sa précision accrue et de sa plus grande robustesse15. De nombreux protocoles de titrage du génome vectoriel par dd_PCR sont disponibles dans la littérature, chacun avec ses propres méthodes de préparation d’échantillons 15,16,17. Cependant, il n’existe pas de protocole de consensus qualifié. Cet article présente un protocole de dd_PCR validé et adapté à l’usage pour la quantification des génomes des vecteurs AAV dans des échantillons de vecteurs purifiés (Figure 2).
Une attention particulière à la manipulation des échantillons est essentielle lors de l’exécution de ce protocole. La contamination croisée peut poser un défi important pour évaluer avec précision les titres de VG ; par conséquent, il est préférable de traiter les échantillons sous un poste de travail PCR pour éviter la contamination par de l’ADN étranger. De plus, la bonne exécution de l’incubation de la DNase est cruciale pour éliminer l’ADN contaminant non emballé sans perturber la capside et potentiellement digérer le génome du vecteur emballé. De nombreux protocoles incluent l’inactivation thermique et le traitement à la protéinase K 16,17,18. Cependant, au cours de la mise au point de méthodes internes, il a été constaté qu’un échauffement excessif nuisait au titrage vg et qu’un traitement par protéinase K n’était pas nécessaire (données non présentées).
Alors que dd_PCR devient de plus en plus populaire pour quantifier les génomes viraux, les fabricants ont publié des guides d’application détaillés avec des directives sur la conception et l’optimisation des tests dd_PCR19. Des informations de dépannage sont également disponibles. En pratique, lorsqu’un test est correctement conçu, les problèmes les plus fréquents incluent la pluie de gouttelettes et le faible nombre de gouttelettes. La pluie de gouttelettes est souvent causée par une mauvaise accessibilité de l’amorce/des sondes à l’amplicon, mais plusieurs stratégies peuvent résoudre ce problème. Par exemple, une expérience de gradient de température peut aider à établir la température de recuit optimale. De plus, la dilution d’échantillons pour réduire la quantité d’ADN (recommandée inférieure à 66 ng) ou la réalisation d’une digestion de restriction avec des enzymes spécifiques qui coupent en dehors de la région de l’amplicon peut améliorer l’accessibilité du modèle. Une recommandation de 10 U d’enzyme de restriction par μg d’ADN est généralement efficace. Le problème du faible nombre de gouttelettes (moins de 10 000) est souvent dû à un mauvais pipetage de l’échantillon et à l’huile dans les cartouches. Un pipetage lent avec des pointes appropriées est recommandé pour éviter le cisaillement des gouttelettes. Bien que le test dd_PCR soit robuste, l’une des limites est le temps prolongé d’obtention des résultats. Le processus, du traitement de l’échantillon à la lecture des gouttelettes, prend plusieurs heures, ce qui peut être un inconvénient lorsque les résultats sont nécessaires rapidement.
La quantification précise des copies du génome de l’AAV dans les préparations de vecteurs est nécessaire à toutes les étapes du cycle de vie de la thérapie génique AAV. Plus précisément, il est important pour optimiser les processus de production et de purification, mener des études précliniques et déterminer les dosages cliniques des produits de thérapie génique à base d’AAV. Le protocole dd_PCR présenté ici est largement applicable et peut être utilisé sur des produits AAV purifiés avec différents sérotypes et transgènes.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été rendue possible grâce à la subvention « Flanders Resilience » du gouvernement flamand, provenant de la « Facilité européenne pour la reprise et la résilience » (FRR) (VV021/13). La figure 2 est créée avec Biorender.com.
8-channel pipette 10 µL | Eppendorf | 3,12,50,00,010 | |
8-channel pipette 200 µL | Eppendorf | 3,12,50,00,036 | |
8-channel pipette 300 µL | Eppendorf | 3,12,50,00,052 | |
8-well PCR strip | Sarstedt | 72.991.002 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
ddPCR Buffer Control for Probes 9 mL (2 x 4.5 mL) | Bio-Rad | 1863052 | |
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) (2 x 1 mL) | Bio-Rad | 1863023 | |
ddPCR 96-Well Plates (pkg of 25) | Bio-Rad | 12001925 | |
ddPCR Droplet Reader Oil (2 x 1L) | Bio-Rad | 1863004 | |
DG8 Cartridge Holder | Bio-Rad | 1863051 | |
DG8 Cartridges for QX200/QX100 (pkg of 24) | Bio-Rad | 1864008 | |
DG8 Gaskets for QX200/QX100 (pkg of 24) | Bio-Rad | 1863009 | |
DNase I (10U/µL) + buffer | Roche | 4716728001 | |
Droplet Generation Oil for Probes (10 x 7 mL) | Bio-Rad | 1863005 | |
Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filter Tip, 0.1-10 μL, 34 mm, Rack, PCR Clean, STERILE | Eppendorf | 30078500 | |
Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filter Tip, 20-300 μL, 55 mm, Rack, PCR Clean, STERILE | Eppendorf | 30078560 | |
Eppendorf ep Dualfilter T.I.P.S. Filter Tip, 2-100 μL, 53 mm, Rack, PCR Clean, STERILE | Eppendorf | 30078543 | |
Forward lyophilized primers and respective master stocks at 100 mM | IDT | GFP as target sequence. Forward primer: 5'-GAACGGCATCAAGGTGAACT-3' | |
Lyopohilized probe and master stock at 100 µM | IDT | GFP as target sequence. PrimeTime Eco Probe: /56-FAM/CAAGATCCG/ZEN/CCACAACATCGAGGA/3IABkFQ/ | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Chemlab Analytical | CL00.1381 | |
Nuclease free water | IDT | 11-04-02-01 | |
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable (pkg of 100) | Bio-Rad | 1814040 | |
Pluronic F-68 non-ionic surfactant (100x) | Thermo Fisher Scientific | 24040032 | |
Potassium Chloride (KCl) | Honeywell research chemicals | 31248 | |
QX manager software | Bio-Rad | Software to analyse ddPCR data | |
QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
Reagent reservoir | VWR | 613-1181 | |
Reverse lyophilized primers and respective master stocks at 100 mM | IDT | GFP as target sequence. Reverse primer: 5'-TGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3' | |
SafeSeal reaction tube, 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.200 | |
Salmon Sperm DNA, sheared (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9680 | |
TE buffer | IDT | Accompanied by primers when ordering | |
Tris hydrochloride (Tris-HCl) | Roche | 10812846001 |