概要

マウス網膜神経節細胞のホールマウント免疫染色および自動計数(英語)

Published: October 04, 2024
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概要

このプロトコルは、ホールマウントマウス網膜を単離し、免疫染色を実施してすべての網膜神経節細胞(RGC)を標識する手順を説明しています。このプロセスに続いて、AIベースのソフトウェアを使用してRGCをイメージングし、自動的にカウントし、マウス網膜全体のRGCを定量するためのシンプルで高速かつ正確な方法を提供します。

Abstract

緑内障は、世界的に失明の主な原因であり、視力回復を困難にする複雑な病原性メカニズムを特徴としています。マウスは、比較的均質な遺伝的背景と、構造的にヒトに類似した網膜神経節細胞(RGC)により、緑内障の病因と治療を研究するための貴重な動物モデルとして機能します。マウス緑内障モデルにおけるRGC損傷と治療結果を正確に評価するには、網膜全体にわたるRGC数を決定する必要があります。このプロトコルは、網膜全体の単離、特定の抗体によるRGCの標識、AIベースのプログラムを使用したRGCの迅速で正確な自動カウントを含む包括的な方法を概説しています。この合理化されたアプローチにより、マウス網膜のRGC数を効率的かつ正確に定量化することができ、RGC変性の評価や治療介入の可能性を高めることができます。研究者がRGC損傷の程度を評価できるようにすることで、このプロトコルは緑内障の病因のより深い理解に貢献し、視力喪失を管理および予防するための効果的な治療戦略の開発を支援します。

Introduction

緑内障は、神経節細胞の進行性の死を特徴とし、視力回復に大きな課題をもたらします1,2。この病気は、その有病率と視力への影響により、眼科研究の主要な焦点です3.マウスモデルは緑内障に欠かせません
その均質な遺伝的背景、高い生殖能力、および神経節細胞の特性とヒトとの類似性による研究4。この方法の主な目標は、マウスモデルにおける網膜神経節細胞(RGC)を正確に定量することであり、これは緑内障の病因を理解し、関連する治療法を開発するために不可欠です。

この手法を開発した根拠は、マウスモデルにおけるRGC変性を評価するための信頼性と効率性に優れた方法の必要性に起因しています。網膜切片におけるRGCの標識などの従来の方法では、網膜5におけるRGCの分布が不均一であるため、信頼性の低い結果が得られることがよくあります。網膜全体にわたるRGCの定量化は、その数の変化をよりよく反映し、疾患の進行と治療介入を評価するために重要です。

この方法には、他の手法に比べていくつかの利点があります。例えば、40,000〜60,000個のRGCを含む正常な成体マウス網膜における網膜神経節細胞(RGC)の手動カウントは、時間がかかり、エラーが発生しやすい場合がある6,7,8。当社が開発した自動RGCカウント用ソフトウェアにより、3分以内に正確なカウントが可能になり、研究者の時間を大幅に節約できる可能性があります。さらに、自動カウントに使用されるAIベースのソフトウェアは、バイアスを最小限に抑え、再現性を向上させます。

さらに、この手法は、さまざまなマウスモデルや実験条件でRGCの変性を評価するための標準化されたアプローチを提供し、緑内障研究の分野に貴重なデータを提供します。この方法は、疾患における網膜の変化を理解するためのホールマウント網膜解析の重要性を強調する他の研究と一致しています9

この方法が自分のアプリケーションに適しているかどうかを判断するために、この手法は、緑内障または他の網膜疾患のマウスモデルで網膜神経節細胞(RGC)変性を研究する研究者にとって特に有利であることに注意することが重要です。この方法は、さまざまな実験設定に適応でき、RGCカウントにおいて高い精度と効率を提供するため、小規模および大規模の研究の両方に最適です。さらに、このプロトコルは分かりやすいデザインで、ユーザーフレンドリーなソフトウェアが利用できるため、網膜解析のさまざまなレベルの専門知識を持つ研究者が利用することができます。

Protocol

この手続きは、研究における動物の使用に関するAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(視覚眼科学研究協会)のガイドラインに準拠しており、四川省人民病院の動物管理・使用委員会(IACUC)によって承認されました。この研究では、C57Bl/6J雄マウス(生後2か月)を使用しました。 図 1 は、ここで説明する全体的な手順を示しています。使用した試?…

Representative Results

このプロトコールでは、マウス網膜のホールマウント免疫染色の方法論を詳しく説明し、綿密な組織調製、正確な抗体インキュベーション、信頼性の高い自動細胞カウントを保証します。この手順により、網膜神経節細胞(RGC)の堅牢な標識と定量が容易になり、さまざまな実験状況での細胞集団の正確な評価が可能になります。この方法は、野生型および緑内障モデ?…

Discussion

このプロトコルは、マウス網膜中のすべての網膜神経節細胞(RGC)を決定する方法を提供し、これは、緑内障研究のためのマウスモデルにおけるRGC変性の進行を監視するために使用することができます。マウスの網膜はデリケートな神経組織5であり、マウスの眼から全身網膜を分離するには繰り返しの練習が必要です。実験中に、固定時間が網膜の形…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

本研究プロジェクトは、中国国家自然科学基金会(82371059(H.Z.))、中国四川省科学技術局(2023JDZH0002(H.Z.))、成都科学技術局(2022-YF05-01984-SN (H.Z.))、四川省人民病院(30320230095(J.Y.)、30420220062(J.Y.))の支援を受けて行われました。

Materials

1× PBS Servicebio G4202
Alexa594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG  (H+L) ThermoFisher A-11012
Anti-BRN3A antibody [EPR23257-285] Abcam ab245230
AutoCount software https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Cloud disk Google drive link https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6 
Cloud disk Baidu link Extraction code: g44k https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg 
Marker Sharpie
Normal Donkey Serum Biosharp, Labgic 25030081
Paraformaldehyde Macklin P804536
ProClean 300 Beyotime ST853
Sucrose BBI, Sangon A610498
Triton X-100 BioFroxx, neoFroxx 1139ML100

参考文献

  1. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).
  2. Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population. Eye. , (2024).
  3. Atkinson, M. J., et al. A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP). Health Qual Life Outcomes. 1, 67 (2003).
  4. Guo, J., et al. A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice. Vision Res. 219, 108397 (2024).
  5. Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).
  6. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  7. Zhang, J., et al. Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5. Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).
  8. Al-Khindi, T., et al. The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization. Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).
  9. Claes, M., Moons, L. Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice. Cells. 11 (17), 2689 (2022).
  10. Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells. J Vis Exp. (194), e65222 (2023).
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記事を引用
Yang, J., Guo, J., Hu, J., Wu, X., Huang, H., Wen, Y., Chen, R., Liu, C., Zhang, H. Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (212), e66991, doi:10.3791/66991 (2024).

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