概要

修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

Published: July 05, 2024
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概要

ここでは、核酸代謝酵素をアッセイするためのプロトコールを、リガーゼ、ヌクレアーゼ、およびポリメラーゼ酵素の例を用いて提示する。このアッセイでは、蛍光標識および非標識オリゴヌクレオチドを組み合わせて、RNAおよび/またはDNAの損傷または経路中間体を模倣した二本鎖を形成することができ、酵素の挙動の特性評価を可能にします。

Abstract

商業ベンダーからさまざまな修飾合成オリゴヌクレオチドが利用できるようになったため、核酸代謝酵素の多様な特性を特徴付ける洗練されたアッセイの開発が可能になり、標準的な分子生物学研究室で実行できます。蛍光標識の使用により、標準的なPAGE電気泳動装置と蛍光対応イメージャーを使用する研究者は、放射性物質を使用したり、放射性物質の保管と調製のために設計されたラボ(ホットラボ)を必要とせずに、これらの方法にアクセスできるようになりました。リン酸化などの標準的な修飾をオプションで追加することで、アッセイのセットアップを簡素化でき、DNA損傷や中間体を模倣する修飾ヌクレオチドを特異的に組み込むことで、酵素の挙動の特定の側面をプローブすることができます。ここでは、市販の合成オリゴヌクレオチドを用いた酵素によるDNAプロセシングのいくつかの側面を調査するアッセイの設計と実行を実証します。これには、リガーゼが結合する能力やヌクレアーゼが異なるDNAおよびRNAハイブリッド構造を分解する能力、DNAリガーゼによる補因子の異なる使用、および酵素のDNA結合能力の評価が含まれます。合成ヌクレオチド基質を設計する際に考慮すべき要素について説明し、さまざまな核酸リガーゼ、ポリメラーゼ、およびヌクレアーゼ酵素アッセイに使用できるオリゴヌクレオチドの基本セットを提供します。

Introduction

すべての生命体は、複製、転写、DNA修復などの基本的な生物学的プロセスを実行するために核酸処理酵素を必要とします。これらの経路の主要な酵素的機能性は、RNA/DNA分子のコピーを生成するポリメラーゼ、ポリヌクレオチド基質を結合するリガーゼ、それらを分解するヌクレアーゼ、および核酸二本鎖を溶かしたり、そのトポロジーを変化させたりするヘリカーゼとトポイソメラーゼです1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 .さらに、これらの酵素の多くは、クローニング、診断、ハイスループットシーケンシングなどのアプリケーションに不可欠な分子ツールを提供します11,12,13,14,15。

これらの酵素の機能特性、速度論、および基質特異性は、オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって産生される標識DNA/RNA基質を用いて決定できます。基板および製品の追跡は、伝統的に、5’鎖端のいずれかに放射性標識(32P)を導入することによって達成され、これはその後、写真フィルムまたは蛍光体イメージングシステム16,17によって検出することができる。放射性標識基質は、実験感度の向上という利点を提供し、ヌクレオチドの化学的性質を変化させないが、放射性同位元素を扱うことによる潜在的な健康被害は、DNAおよびRNA検出のためのより安全な代替手段を提供するための非放射性核酸標識の開発を促進している18,19,20.これらの中で、直接蛍光検出、時間分解蛍光、エネルギー移動/蛍光消光アッセイなどの蛍光検出は、最も汎用性の高いアッセイとして際立っています21,22,23,24。広範な蛍光色素の配列により、各オリゴヌクレオチド25上に独自のレポーターを特徴とするDNA/RNA基質の異なる設計が可能になります。さらに、蛍光色素の安定性は、放射性同位元素と比較した場合、ユーザーは蛍光標識されたDNA基質を大量に生成し保存することができる19。これらの蛍光色素標識基質は、目的のタンパク質とインキュベートし、金属およびヌクレオチド補因子のさまざまな組み合わせとともに、結合活性や酵素活性を解析できます。結合または活性の可視化は、ゲルイメージングシステムを備えたさまざまな蛍光色素チャネルを使用して観察できます。この手法では蛍光標識されたオリゴヌクレオチドのみが見えるため、標識されたオリゴヌクレオチドのサイズの増減を容易に追跡できます。ゲルは、その後、核酸染色色素を使用してゲル上に存在するすべてのDNAバンドを視覚化することもできます。

ポリ核酸リガーゼは、DNA/RNAの断片を結合する酵素であり、5’リン酸化DNA末端とDNAの3’OHとの間のホスホジエステル結合の形成により、切断のシーリングを触媒します。それらは、ヌクレオチド基質の要件に応じて2つのグループに分けることができます。高度に保存されたNAD依存性リガーゼはすべての細菌に見出され26、構造的に多様なATP依存性酵素は、生命の全ての領域を通じて同定することができる8,27。DNAリガーゼは、複製中の岡崎フラグメントプロセシングに重要な役割を果たすとともに、自発的な傷や修復後に残る傷の封鎖を通じて、ヌクレオチドや塩基除去修復などのさまざまなDNA修復経路に関与しています8,10。異なるDNAリガーゼは、二本鎖のニック、二本鎖切断、ミスマッチ、ギャップ、ならびにRNAおよびDNAハイブリッド28,29,30を含む、DNA切断の異なるコンフォメーションを結合するさまざまな能力を示す。オリゴヌクレオチドを5’リン酸でアニーリングすることにより、多様な結合性基質を組み立てることができ、核酸二本鎖31,32,33に並置された5’末端と3’末端を生成します。最も一般的な分析方法は、エンドポイントアッセイ形式での尿素PAGEによる分離です。しかし、最近の技術革新には、ハイスループットを可能にするキャピラリーゲル電気泳動34、質量分析プロファイリング35、および時間分解モニタリング36を可能にする均質分子ビーコンアッセイの使用が含まれる。

ライゲーション反応の最初のステップは、アデノシン三リン酸(ATP)またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)によるリガーゼ酵素のアデニル化であり、共有結合酵素中間体が得られます。反応の第2ステップは、ニック部位の5’末端の核酸基質のアデニル化であり、続いて核酸ニック鎖のライゲーションが行われます。 大腸菌 で組換え発現する多くのリガーゼ酵素は、アデニル化形態で精製されるため、ヌクレオチド補因子を添加することなく核酸をうまくライゲーションすることができます。これにより、核酸のライゲーションに必要な特定のタイプのヌクレオチド補因子を決定することが困難になります。DNAリガーゼ活性を評価するためのアッセイについて説明するだけでなく、非標識基質を用いて酵素を脱アデニル化することにより補因子の使用量を確実に決定する方法も提示されます。

ヌクレアーゼは、DNA/RNA修飾酵素および触媒RNAの大規模で多様なグループであり、核酸間のホスホジエステル結合を切断する37。ヌクレアーゼ酵素の機能は、DNAの複製、修復、およびRNAプロセシングに必要であり、DNA、RNA、またはその両方に対する糖特異性によって分類できます。エンドヌクレアーゼはDNA/RNA鎖内のホスホジエステル結合を加水分解し、一方、エキソヌクレアーゼはDNA/RNA鎖を3’または5’末端から一度に1ヌクレオチドを加水分解し、DNA38の3’末端から5’末端または5’末端から3’末端のいずれかから加水分解することができる。

多くのヌクレアーゼタンパク質は非特異的であり、複数のプロセスに関与している可能性があるが、他のタンパク質は特定の配列またはDNA損傷に対して非常に特異的である6,39,40。配列特異的ヌクレアーゼは、クローニング、突然変異誘発、ゲノム編集など、幅広いバイオテクノロジー用途で使用されています。これらのアプリケーションのための一般的なヌクレアーゼは、制限ヌクレアーゼ41、ジンクフィンガーヌクレアーゼ42、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、そして最近では、RNA誘導改変CRISPRヌクレアーゼ43である。最近、損傷特異的なヌクレアーゼが同定されており、例えばEndoMSヌクレアーゼは、ミスマッチ特異的なRecB様ヌクレアーゼドメイン5,44を通じてDNAのミスマッチに対して特異性を有する。ヌクレアーゼ活性アッセイは、歴史的に、放射性標識基質を用いた不連続アッセイとして行われてきました。しかしながら、それらの他の欠点に加えて、これらは、蛍光標識基質45,46を使用する場合に可能なヌクレアーゼタンパク質によって切断された部位の同定を可能にしない。最近では、さまざまな状態でDNAと相互作用するさまざまなDNA色素を使用して機能する連続ヌクレアーゼアッセイが開発されました。例えば、dsDNAと相互作用するとき、その非結合状態よりも高い蛍光シグナルを放出するか、または短いRNAに特異的に結合する47。他の連続ヌクレアーゼアッセイでは、5’にフルオロフォア基、3’末端にクエンチャーを持つDNAヘアピンを使用し、フルオロフォアとクエンチャー48の分離によりオリゴヌクレオチドが分解されるにつれて蛍光が増加するようにします。これらのアッセイでは、DNA分解タンパク質の動態を特徴付けることができますが、酵素の機能と基質に関する事前の知識が必要であり、また、DNAコンフォメーションを変化させて色素結合に違いを引き起こす酵素に限定されます。このため、個々のヌクレアーゼ産物を分離するエンドポイントアッセイは、タンパク質活性によって引き起こされるDNA修飾に関する洞察を得るために依然として望ましいです。

ここでは、新規ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、およびリガーゼ酵素の活性を試験するための基質を生成するために混合および適合させることができる蛍光標識DNA/RNAオリゴヌクレオチドの設計に関する詳細な手順を示します。このオリゴヌクレオチド配列の基本セットの検証により、実験デザインが簡素化され、特注の基質を大量に購入することなく、幅広い酵素機能の経済的なプロファイリングが容易になります。DNAリガーゼ活性の例を用いて、これらの基質を用いて標準的なDNAプロセッシング酵素アッセイを実行するための詳細な手順が提供され、ヌクレアーゼおよびポリメラーゼ酵素をアッセイおよび分析するための修飾が説明されている。さらに、DNAリガーゼ酵素の補因子特異性を高精度で決定するための修正アッセイが提供され、二重標識プローブを使用して多成分ライゲーションの集合が評価されます。最後に、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によって同じ基質とのタンパク質-DNA相互作用を決定するために使用できるようにするための基本的なアッセイフォーマットの変更について説明します。

Protocol

1. オリゴヌクレオチドの設計と購入 注:一本鎖オリゴヌクレオチドを設計し、アセンブルして目的の二本鎖にアニーリングします。二本鎖中の1本以上の鎖は、目的の酵素によるオリゴヌクレオチドプロセシングを追跡するための蛍光部分を有していなければならない。さまざまな活動に対してアセンブルできる一本鎖配列の基本セットを 表1に示します。 以下に説明するように、目的の酵素に必要な特定の修飾を組み込みます。DNAリガーゼ基質(図1)の場合:3つのオリゴヌクレオチド(5’リン酸化ドナー鎖(NL2)、5′ FAM標識アクセプター鎖(NL1)、および2つを架橋する補体(NL3)から最も単純な基質を組み立てます。ステップ2で基質マスターミックスを組み立てる前に、結紮可能なニックの5’末端を提供するストランドがリン酸化されていることを確認してください。これをNL2の修飾として注文するか( 表1を参照)、またはオリゴヌクレオチドを再懸濁した後、T4ポリヌクレオチドキナーゼによる酵素的リン酸化を使用してください。 図1A(NL6/NL7およびNL8/NL9)に示されている二本鎖切断の補体を含むNL6およびNL8の5’末端リン酸化を含む、これは制限エンドヌクレアーゼから産生される天然基質に最も近い。二重標識基板を使用して、マルチパートアセンブリのライゲーションの相対的な範囲を決定します(ステップ6を参照)。 補数ストランドを変更して、ミスマッチ (NL10) とギャップ (NL11) を生成します。注意: 単純な傷のある基板のバリエーションを 図1Aに示します。他のシーケンスを使用して、下線の位置を変えることにより、さらに広い範囲の不一致またはより長いギャップを生成することができます。 RNAオリゴヌクレオチドの代わりにDNAオリゴヌクレオチドを添加します。注:単純な傷のある基板のバリエーションを 図1Bに示します。より広範なDNA/RNA二本鎖は、例えば、RNAとDNAの両方を含む二本鎖切断を生成するために、ここで与えられた基底セットの追加の組み合わせによって生成することができる。このバリエーションの例を、デュアルラベル方式を使用する以下のステップ 6 に示します。 DNAポリメラーゼ基質の場合: 表1 にリストされているオリゴヌクレオチドNL1およびNL3を組み立てて、簡単なプライマー伸長アッセイを行います。NL1(プライマー)またはNL3(テンプレート)鎖に修飾を導入することにより、ポリメラーゼ活性のさらなる側面を調査します。損傷した塩基類似体を位置20の前にNL3オリゴヌクレオチドに組み込み、テンプレート鎖上の損傷した病変を回避する能力を判断します。 損傷した塩基アナログをNL1オリゴヌクレオチドの20位に組み込み、損傷したプライマーを伸長する能力を判断します。 二本鎖でRNL1またはRNL3のいずれかを使用して、RNAプライマーの伸長またはRNAテンプレートの使用を調査します。 ヌクレアーゼ基質(図2)の場合:オリゴヌクレオチドをアセンブルして、非網羅的な範囲の二本鎖および一本鎖基質(図2Ai)、フラップおよび拡散した接合部(図2Aii)、および損傷した基質(図2B)を生成します。リボヌクレアーゼ活性を調べるには、NL1、NL2、NL3をRNL1、RNL2、RNL3に繰り返し置換します。HJ5およびHJ6の追加のRNAバージョンを使用して、このセットをさらに拡大します。 酸化的損傷を模倣する修飾が中央に配置されたオリゴヌクレオチド、非塩基性修復中間体、または脱アミノ化生成物であるオリゴヌクレオチドMD5、MD6、およびMD9を使用してください(図2B)。基板は、この位置でのストランドの切断を検出します。補体NL3鎖をTAMRAなどの直交蛍光色素で標識し、二本鎖切断を検出します(ステップ6を参照)。 補体の直交標識を使用して、プローブ(NL5およびND9)と補体(MD10およびNL10)の両方のストランドの不一致部位での二本鎖切断を検出します。 関連する蛍光色素やその他の修飾を組み込んだ合成オリゴヌクレオチドを商業ベンダーに注文してください。注:100 nMの合成スケールおよび合成後のHPLC精製は、記載されているアッセイに適しています。 2. 核酸二本鎖の組み立てとアニーリング オリゴヌクレオチドの再懸濁と希釈開封する前に、凍結乾燥されたオリゴヌクレオチドを2 mLチューブに入れ、卓上型遠心分離機で2〜5分間全速力で遠心分離し、核酸がチューブの底にあることを確認します。 オリゴヌクレオチドをTEバッファー(10 mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)、1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA))に再懸濁することにより、100 μMのマスターストックを調製します。オリゴヌクレオチドが、穏やかなボルテックスと短時間の遠心分離を全速力で繰り返して、完全に再懸濁されていることを確認します。 10 μM ストックを調製するには、マスターストックのアリコートを TE バッファーで希釈します。表2に示すように、10 μMのストックを超純水(MQ水)で希釈して、 0.5 μM、0.7 μM、または2.5 μMの濃度のワーキングストックを調製します。 反応マスターミックスの組み立てとアニーリングワーキングストックを使用して、 表2 に示す組み合わせと 表3に示す容量を使用して反応マスターミックスを調製します。標準的なDNAリガーゼアッセイおよびここで説明する他のほとんどのアッセイでは、最終的な緩衝液組成は50 mM Tris pH 8.0、50 mM NaCl、10 mMジチオスレイトール(DTT)、10 mM Mgを二価カチオンとします。 PCRチューブまたは微量遠心チューブ内で、加熱ブロックまたはサーモサイクラーを使用して95°Cで5分間加熱することにより、オリゴヌクレオチドをアニーンします。室温で30分間(容量1 mL)冷まします。.オリゴヌクレオチド(>40 nt)を長時間使用する場合は、95 °Cから25 °Cの下降ランプを持つサーモサイクラーを使用して45分間ゆっくりと冷却するか、アニーリング混合物の入ったチューブを沸騰水の入った1 Lビーカーに浮かべて室温まで一晩冷却します。 ヌクレオチド補因子およびその他の熱に弱い緩衝成分を、室温まで冷却した後、マスターミックスに加えます。最終反応混合物を酵素を添加してアッセイに直接使用するか(下記のステップ3を参照)、または将来の使用のために-20°Cで保存してください。 3. 標準アッセイセットアップ アッセイ反応の組み立てと開始目的の基質マスターミックス22.5 μLと、PCRチューブ内のDNAリガーゼまたは他の目的酵素2.5 μLを組み合わせます。反応を重複または三重に実行し、特に結果が定量化される場合はなおさらです。 アッセイサンプルにタンパク質なしコントロール(バッファーのみ)を含めます。必要に応じて、この時点では補因子コントロールを含めないでください。注:酵素は50% v/vグリセロール中に-20°Cで保存できるため、溶液から直接ピペットで移すことができます。グリセロールを含む酵素溶液は、添加する前に、ピペッティングで混合するか、穏やかなボルテックスで混合することにより、十分に混合されていることを確認してください。 直ちに反応液を25°CのPCR装置に移し、30分間インキュベートします。酵素活性の最適条件に応じて、温度と持続時間を変えます。 ローディング色素(95%ホルムアミド、0.5 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ブロモフェノールブルー)5 μLを加えて反応を急冷し、95°Cで5分間インキュベートします。 4. アッセイ結果の解析 トリス-ホウ酸-EDTA(TBE)-尿素PAGEゲルを以下のように調製します。20%アクリルアミド、7 M尿素、および1x TBE溶液のストックを調製します。ここで説明するオリゴヌクレオチドセットについては、アクリルアミド/ビス溶液を29:1の比率で使用して、最適な分離を実現します。 1つのゲルについて、10 mLの20%アクリルアミドと7 M尿素溶液を100 μLのAPS(10%)および3 μLのテトラメチルエチレンジアミン(TMED)と組み合わせ、ゲルキャスターでキャストします。 ゲルが固まったら、45〜55°CのTBE尿素ゲルでサンプルを分析します。ゲルを1x TBEバッファーで30分間、ゲルあたり10mAで外部加熱して予備分析します。 パスチャーピペットを使用して1x TBEでフラッシングすることにより、ゲルのウェル内の余分な尿素を除去します。 各反応を10μL負荷し、外部加熱で10mAで1.0〜1.5時間運転します。 イメージャーでゲルを可視化し、選択した蛍光色素に適した設定で行います。FAMの場合、495/519 nmで励起/発光を与えるフィルターセットを使用します。これは、ほとんどのイメージャーにプリセットとして保存されています。 イメージャを備えた画像処理ソフトウェア、またはImageJ49,50などの外部プログラムを使用して、製品と基板のバンド強度を定量化し、次の式を使用して製品のパーセンテージを計算しますここで、 P は製品バンドの積分値、 S は基板バンドの積分面積です。DNAリガーゼ反応の例の場合、生成物バンドは40ヌクレオチド(nt)で、基質バンドは20ntで実行されます。 5. 補因子特異性をテストするためのDNAリガーゼの脱アデニル化 反応マスターミックスの調製表4に記載されているように、FAM標識NL1オリゴヌクレオチドを含むマスターミックスを1セット調製します。表4に示すように、NL1オリゴヌクレオチドを含むFAM標識のない2番目のセットを調製します。 これとは別に、両方のDNA二本鎖を95°Cで5分間加熱し、25°Cで30分間から1時間冷却します。 どちらのマスターミックスにもヌクレオチド補因子を添加しないでください。 脱アデニル化反応の組み立てと開始試験する補因子の種類/濃度ごとに、10 μLの非標識マスターミックスと2.5 μLのリガーゼ酵素を組み合わせて、1回の脱アデニル化反応を準備します。 補因子コントロールなしおよびタンパク質コントロールなしとして追加のチューブを準備します(酵素の代わりに2.5 μLのバッファーを添加)。 酵素の最適活性に特異的な温度で反応を1〜2時間インキュベートします。酵素がまだアデニル化されている場合は、インキュベーション時間を長くすることができます。 補因子でライゲーション反応を実行します。標識マスターミックス10 μLと目的のヌクレオチド補因子(ATP、NAD、ADP、GTPなど)2.5 μLを脱アデニル化反応(最終濃度0.1-1 mM)に直接添加します。 2.5 μLの反応バッファーを無塩基補因子コントロールに加えます。 反応を以前に使用したのと同じ期間および温度でインキュベートします。ステップ 4 の説明に従って、クエンチと視覚化を行います。 6. スプリントライゲーションまたはマルチパートアセンブリのための二重標識基板の使用 すでに使用されている蛍光色素とは異なる励起/発光スペクトルを持つ蛍光部分を持つオリゴヌクレオチドを設計し、購入します。ここで説明するセットアップでは、3’末端に5-カルボキシテトラメチルローダミン(TAMRA)を持つNL2(TAMRA)オリゴヌクレオチドを使用します(表1)。 以下に説明するようにマスターミックスを組み立てます。ステップ2で説明した反応の成分(アセンブリで使用されるすべてのオリゴヌクレオチドの等モル比、バッファーおよび二価カチオンなど)を組み合わせます。 95°Cで5分間加熱し、25°Cで30分間-1時間冷却してアニールします。補因子と酵素を添加し、ステップ3で説明したようにインキュベートします。 ステップ4で説明したように、基板中の蛍光色素ペアの適切なチャンネルを使用してサンプルを泳動し、イメージングします。FAMおよびTAMRAの場合、これらはほとんどのイメージャーに存在するフルオレセイン(FITC)およびテトラメチルローダミン(TRITC)チャネルです。 7. 天然ゲル上の電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によるDNA結合の評価 以下に説明するように、10%ネイティブTBE PAGEゲルを調製します。2.5 mLの40%アクリルアミド、10x TBE1 mL、100 μLの10% APS、3 μLのTMED、および6.5 mLのMQ水を混合し、ゲルキャスターにキャストします。 以下に説明するように結合反応を組み立てます。EMSA基板を 表5 に従って組み立て、EDTA(10 mM)が含まれ、金属イオンが省略されるようにします。 20 μL の EMSA 基質マスターミックスと 5 μL のタンパク質を PCR チューブで組み合わせます。タンパク質コントロールなしのサンプルを含めてください。25°Cで30分間インキュベートします。 以下に説明するように、ネイティブ電気泳動による分析を行います。5x ネイティブローディング色素 (100 mM EDTA、0.25 % ブロモフェノールブルー、25% v/v グリセロール、MQ 水 1 mL まで) 5 μL をサンプルに加えます。 調製したゲルに負荷をかけ、60Vで2〜3時間運転し、染料の前面がゲルの端から数cm上になるまで水循環で冷却します。 ステップ4の説明に従ってゲルを視覚化および分析します。

Representative Results

DNAリガーゼによるライゲーションDNAリガーゼの酵素活性は、尿素PAGEゲル上で可視化すると、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドのサイズの増加をもたらします。 表2にリストされているDNAライゲーションとRNAライゲーションの両方の基質の場合、これは20 ntから40 ntへのサイズの倍増に相当します(図3A)。最適な酵素活性は、温度、タンパク質…

Discussion

プロトコルの重要なステップ
オリゴヌクレオチドの設計と購入:二本鎖形成用のオリゴヌクレオチドを購入する際には、配列設計を考慮することが不可欠です。オリゴ分析装置ツールを使用して、GC含量、融解温度、二次構造、二量体化電位などのヌクレオチド配列の特性を予測することをお勧めします57

核酸二本鎖のアセンブルとアニ…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AWは、ラザフォードディスカバリーフェローシップ(20-UOW-004)によってサポートされています。RSは、ニュージーランド ポスト南極奨学金 の受給者です。SGとURは、ノルウェー北極大学トロムソ化学研究所の技術サポートに感謝しています。

Materials

30% Acrylamide/Bis Solution (29:1) BioRad 1610156
Adenosine triphosphate (ATP) Many suppliers
Ammonium persulfate (APS) Many suppliers
Benchtop centrifuge Many suppliers
Borate Many suppliers
Bromophenol blue Many suppliers
Dithiothreitol (DTT) Many suppliers
Electrophoresis system with circulating water bath Many suppliers
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Many suppliers
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000 Thermo Fisher Scientific A32752
Formamide Many suppliers
Gel casting system Many suppliers
Heating block Many suppliers
Magnesium Chloride Many suppliers Other metal ions may be preferred depending on the protein studied
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Many suppliers
Micropipettes and tips Many suppliers 1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) Many suppliers
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies NA Thermo Fisher, Sigma-Aldrich,  Genscript and others also supply these
pasture pipette Many suppliers
PCR thermocycler Many suppliers
PCR tubes Many suppliers
RNAse away ThermoFisher 7002PK Only needed when working with RNA oligos
RNase AWAY Merck 83931-250ML Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces
RNAse-free water New England Biolabs B1500L Only needed when working with RNA oligos
Sodium Chloride Many suppliers
SUPERase IN RNase inhibitor Thermo Fisher Scientific AM2694 Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based)
SYBR Gold Thermo Fisher Scientific S11494 This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides
Tetramethylethylenediamine (TMED) Many suppliers
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane Many suppliers
Ultrapure water (Milli-Q) Merck
urea Many suppliers
Vortex Many suppliers

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記事を引用
Stelzer, R., Rzoska-Smith, E., Gundesø, S., Rothweiler, U., Williamson, A. Using Modified Synthetic Oligonucleotides to Assay Nucleic Acid-Metabolizing Enzymes. J. Vis. Exp. (209), e66930, doi:10.3791/66930 (2024).

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