Hier wird ein Protokoll zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen vorgestellt, wobei Beispiele von Ligasen-, Nuklease- und Polymerase-Enzymen verwendet werden. Der Assay verwendet fluoreszenzmarkierte und unmarkierte Oligonukleotide, die zu Duplexen kombiniert werden können, die RNA- und/oder DNA-Schäden oder Signalwegzwischenstufen nachahmen, was die Charakterisierung des Enzymverhaltens ermöglicht.
Die Verfügbarkeit einer Reihe von modifizierten synthetischen Oligonukleotiden von kommerziellen Anbietern hat die Entwicklung ausgefeilter Assays zur Charakterisierung verschiedener Eigenschaften von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen ermöglicht, die in jedem Standardlabor für Molekularbiologie durchgeführt werden können. Die Verwendung von Fluoreszenzmarkierungen hat diese Methoden für Forscher mit Standard-PAGE-Elektrophoresegeräten und einem fluoreszenzfähigen Imager zugänglich gemacht, ohne dass radioaktive Materialien verwendet werden müssen oder ein Labor für die Lagerung und Aufbereitung von radioaktiven Materialien erforderlich ist, d. h. ein Hot Lab. Die optionale Hinzufügung von Standardmodifikationen wie Phosphorylierung kann den Assay-Aufbau vereinfachen, während der spezifische Einbau von modifizierten Nukleotiden, die DNA-Schäden oder Zwischenprodukte nachahmen, verwendet werden kann, um spezifische Aspekte des Enzymverhaltens zu untersuchen. Hier wird das Design und die Durchführung von Assays zur Untersuchung verschiedener Aspekte der DNA-Prozessierung durch Enzyme unter Verwendung kommerziell verfügbarer synthetischer Oligonukleotide demonstriert. Dazu gehören die Fähigkeit von Ligasen, sich zu verbinden, oder von Nukleasen, verschiedene DNA- und RNA-Hybridstrukturen abzubauen, die unterschiedliche Verwendung von Cofaktoren durch die DNA-Ligase und die Bewertung der DNA-Bindungskapazität von Enzymen. Faktoren, die bei der Entwicklung synthetischer Nukleotidsubstrate zu berücksichtigen sind, werden diskutiert, und es wird ein grundlegender Satz von Oligonukleotiden bereitgestellt, die für eine Reihe von Nukleinsäure-Ligasen-, Polymerase- und Nuklease-Enzym-Assays verwendet werden können.
Alle Lebensformen benötigen Nukleinsäure-verarbeitende Enzyme, um grundlegende biologische Prozesse durchzuführen, einschließlich Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. Wichtige enzymatische Funktionalitäten für diese Signalwege sind Polymerasen, die Kopien von RNA/DNA-Molekülen erzeugen, Ligasen, die Polynukleotidsubstrate verbinden, Nukleasen, die sie abbauen, sowie Helikasen und Topoisomerasen, die Nukleinsäure-Duplexe schmelzen oder ihre Topologie verändern 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Darüber hinaus bieten viele dieser Enzyme wichtige molekulare Werkzeuge für Anwendungen wie Klonierung, Diagnostik und Hochdurchsatz-Sequenzierung 11,12,13,14,15.
Die funktionellen Eigenschaften, die Kinetik und die Substratspezifitäten dieser Enzyme können unter Verwendung von markierten DNA/RNA-Substraten bestimmt werden, die durch Annealing-Oligonukleotide hergestellt werden. Die Verfolgung von Substraten und Produkten wurde traditionell durch Einbringen einer radioaktiven Markierung (32P) entweder am 5′-Strangende erreicht, die dann durch einen fotografischen Film oder mit einem Phosphorbildgebungssystem16,17 detektiert werden kann. Während radioaktiv markierte Substrate den Vorteil einer erhöhten experimentellen Empfindlichkeit bieten und die chemischen Eigenschaften eines Nukleotids nicht verändern, haben die potenziellen Gesundheitsgefahren durch die Arbeit mit Radioisotopen die Entwicklung der nicht-radioaktiven Nukleinsäuremarkierung gefördert, um eine sicherere Alternative für den DNA- und RNA-Nachweis zu bieten 18,19,20. Unter diesen sticht die Fluoreszenzdetektion, einschließlich der direkten Fluoreszenzdetektion, der zeitaufgelösten Fluoreszenz und der Energietransfer-/Fluoreszenzquench-Assays, als die vielseitigsten hervor 21,22,23,24. Das umfangreiche Array an Fluorophoren ermöglicht unterschiedliche Designs von DNA/RNA-Substraten mit einzigartigen Reportern auf jedem Oligonukleotid25. Darüber hinaus ermöglicht die Stabilität von Fluorophoren im Vergleich zu Radioisotopen den Anwendern, signifikante Mengen fluoreszenzmarkierter DNA-Substrate herzustellen und zu konservieren19. Diese Fluorophor-markierten Substrate können mit dem interessierenden Protein zusammen mit verschiedenen Kombinationen von Metall- und Nukleotid-Cofaktoren inkubiert werden, um die Bindungs- und/oder Enzymaktivität zu analysieren. Die Visualisierung der Bindung oder Aktivität kann unter Verwendung verschiedener Fluorophor-Farbstoffkanäle mit einem Gel-Imaging-System beobachtet werden. Da bei dieser Technik nur die fluoreszenzmarkierten Oligonukleotide sichtbar sind, ist jede Zunahme oder Abnahme der Größe des markierten Oligonukleotids leicht zu verfolgen. Gele können auch nachträglich mit Nukleinsäure-Färbefarbstoffen gefärbt werden, um alle auf dem Gel vorhandenen DNA-Banden sichtbar zu machen.
Polynukleinsäure-Ligasen sind Enzyme, die DNA/RNA-Fragmente verbinden und die Versiegelung von Brüchen durch die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen 5′-phosphorylierten DNA-Termini und dem 3′-OH der DNA katalysieren. Sie können entsprechend ihrer Anforderung an das Nukleotidsubstrat in zwei Gruppen unterteilt werden. Die hochkonservierten NAD-abhängigen Ligasen kommen in allen Bakterienvor 26, während die strukturell vielfältigen ATP-abhängigen Enzyme in allen Lebensbereichen identifiziert werden können 8,27. DNA-Ligasen spielen eine wichtige Rolle bei der Verarbeitung von Okazaki-Fragmenten während der Replikation und sind an verschiedenen DNA-Reparaturwegen beteiligt, wie z. B. der Nukleotid- und Basenexzisionsreparatur, durch die Versiegelung von spontanen Kerben und Kerben, die nach der Reparatur übrig bleiben 8,10. Verschiedene DNA-Ligasen weisen unterschiedliche Fähigkeiten auf, verschiedene Konformationen von DNA-Brüchen zu verbinden, einschließlich Kerben in einem Duplex, doppelsträngige Brüche, Fehlanpassungen und Lücken sowie RNA- und DNA-Hybride 28,29,30. Eine Vielzahl von ligierbaren Substraten kann durch Glühen von Oligonukleotiden mit einem 5′-Phosphat zusammengesetzt werden, um nebeneinander liegende 5′- und 3′-Termini in einem Nukleinsäureduplex 31,32,33 zu erzeugen. Die gebräuchlichste Analysemethode ist die Auflösung durch Harnstoff-PAGE in einem Endpunkt-Assay-Format; Zu den jüngsten Innovationen gehören jedoch die Verwendung der Kapillargelelektrophorese, die einen hohen Durchsatz34 ermöglicht, die massenspektrometrische Profilierung35 sowie ein homogener molekularer Beacon-Assay, der eine zeitaufgelöste Überwachungermöglicht 36.
Der erste Schritt in einer Ligationsreaktion ist die Adenylierung des Ligase-Enzyms durch Adenosintriphosphat (ATP) oder Nicotinamid-Adenindinukleotid (NAD), wodurch ein kovalentes Enzymzwischenprodukt entsteht. Der zweite Schritt in der Reaktion ist die Adenylierung des Nukleinsäuresubstrats am 5′-Ende der Nickstelle, gefolgt von der Ligation der Nukleinsäure-Nick-Stränge. Viele Ligase-Enzyme, die in E. coli rekombinant exprimiert werden, werden in der adenylierten Form gereinigt und sind daher in der Lage, Nukleinsäuren ohne Zugabe eines Nukleotid-Cofaktors erfolgreich zu ligieren. Dies macht es schwierig zu bestimmen, welche Art von Nukleotid-Cofaktor sie für die Ligation von Nukleinsäuren benötigen. Neben der Beschreibung von Assays zur Bewertung der DNA-Ligase-Aktivität wird auch eine Methode zur zuverlässigen Bestimmung des Cofaktor-Einsatzes durch Deadenylierung des Enzyms unter Verwendung unmarkierter Substrate vorgestellt.
Nukleasen sind eine große und vielfältige Gruppe von DNA/RNA-modifizierenden Enzymen und katalytischen RNAs, die die Phosphodiesterbindungen zwischen Nukleinsäuren spalten37. Nuklease-Enzymfunktionalitäten sind für die DNA-Replikation, -Reparatur und -Verarbeitung erforderlich und können nach ihrer Zuckerspezifität für DNA, RNA oder beides klassifiziert werden. Endonukleasen hydrolysieren die Phosphodiesterbindungen innerhalb eines DNA/RNA-Strangs, während Exonukleasen DNA/RNA-Stränge jeweils ein Nukleotid vom 3′- oder 5′-Ende hydrolysieren und dies entweder vom 3′- bis 5′- oder vom 5′- bis 3′-Ende der DNA38 tun können.
Während viele Nukleaseproteine unspezifisch sind und an mehreren Prozessen beteiligt sein können, sind andere hochspezifisch für eine bestimmte Sequenz oder DNA-Schädigung 6,39,40. Sequenzspezifische Nukleasen werden in einer Vielzahl biotechnologischer Anwendungen eingesetzt, wie z. B. Klonierung, Mutagenese und Genome Editing. Beliebte Nukleasen für diese Anwendungen sind Restriktionsnukleasen41, Zinkfinger-Nukleasen42, transkriptionelle Aktivator-ähnliche Effektor-Nukleasen und zuletzt die RNA-gesteuerten technisch hergestellten CRISPR-Nukleasen43. In jüngster Zeit wurden schadensspezifische Nukleasen identifiziert, wie z. B. die EndoMS-Nuklease, die durch ihre Mismatch-spezifische RecB-ähnliche Nukleasedomäne Spezifität für Fehlanpassungen in der DNA aufweist 5,44. Nukleaseaktivitätsassays wurden in der Vergangenheit als diskontinuierliche Assays mit radioaktiv markierten Substraten durchgeführt; Zusätzlich zu ihren anderen Nachteilen erlauben diese jedoch nicht die Identifizierung der Stelle, die von einem Nukleaseprotein durchtrennt wird, was bei Verwendung fluoreszenzmarkierter Substrate möglich ist45,46. In jüngerer Zeit wurden kontinuierliche Nuklease-Assays entwickelt, bei denen verschiedene DNA-Farbstoffe verwendet werden, die mit DNA in unterschiedlichen Zuständen interagieren. zum Beispiel die Emission eines höheren Fluoreszenzsignals bei der Wechselwirkung mit dsDNA als in ihrem ungebundenen Zustand oder die spezifische Bindung an kurze RNAs47. Andere kontinuierliche Nuklease-Assays verwenden DNA-Haarnadeln mit einer Fluorophorgruppe am 5′-Ende und einem Quencher am 3′-Ende, so dass die Fluoreszenz zunimmt, wenn das Oligonukleotid aufgrund einer Trennung des Fluorophors und des Quenchers48 abgebaut wird. Diese Assays ermöglichen es zwar, die Kinetik von DNA-abbauenden Proteinen zu charakterisieren, sie erfordern jedoch Vorkenntnisse über die Funktion und das Substrat des Enzyms und sind auch auf Enzyme beschränkt, die die DNA-Konformation verändern, um einen Unterschied in der Farbstoffbindung zu verursachen. Aus diesem Grund sind Endpunkt-Assays, die einzelne Nukleaseprodukte auflösen, nach wie vor wünschenswert, um Einblicke in DNA-Modifikationen zu geben, die durch Proteinaktivität verursacht werden.
Hier wird ein detailliertes Verfahren für das Design von fluoreszenzmarkierten DNA/RNA-Oligonukleotiden vorgestellt, die gemischt und angepasst werden können, um Substrate zum Testen der Aktivität neuartiger Nuklease-, Polymerase- und Ligaseenzyme zu erzeugen. Die Validierung dieses Basissatzes von Oligonukleotidsequenzen vereinfacht das experimentelle Design und ermöglicht die wirtschaftliche Profilierung einer Vielzahl enzymatischer Funktionalitäten, ohne dass eine große Anzahl maßgeschneiderter Substrate gekauft werden muss. Es wird ein detailliertes Verfahren zum Durchführen eines Standard-DNA-prozessierenden Enzymassays mit diesen Substraten am Beispiel der DNA-Ligaseaktivität bereitgestellt und Modifikationen für das Assaying und die Analyse von Nuklease- und Polymeraseenzymen beschrieben. Darüber hinaus wird ein modifizierter Assay zur Bestimmung der Cofaktor-Spezifität des DNA-Ligase-Enzyms mit hoher Genauigkeit gegeben, und es werden dual-markierte Sonden verwendet, um die Assemblierung von Mehrkomponenten-Ligationen zu bewerten. Schließlich werden Modifikationen am Basis-Assay-Format diskutiert, um es zur Bestimmung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit denselben Substraten durch den electrophoretic mobility shift assay (EMSA) zu ermöglichen.
Kritische Schritte im Protokoll
Oligonukleotiddesign und -kauf: Beim Kauf von Oligonukleotiden für die Duplexbildung ist es wichtig, das Sequenzdesign zu berücksichtigen. Es wird empfohlen, vor der Bestellung ein Oligo-Analysewerkzeug zu verwenden, um die Eigenschaften der Nukleotidsequenz wie GC-Gehalt, Schmelztemperatur, Sekundärstruktur und Dimerisierungspotenzial vorherzusagen57.
Assemblierung und Annealing von Nukleinsäure-Duplexen: Bei der …
The authors have nothing to disclose.
AW wird durch ein Rutherford Discovery Fellowship (20-UOW-004) unterstützt. RS ist Empfänger eines neuseeländischen Postantarktis-Stipendiums. SG und UR danken dem Chemischen Institut an der Universität Tromsø – der Norwegischen Arktis-Universität – für die technische Unterstützung.
30% Acrylamide/Bis Solution (29:1) | BioRad | 1610156 | |
Adenosine triphosphate (ATP) | Many suppliers | ||
Ammonium persulfate (APS) | Many suppliers | ||
Benchtop centrifuge | Many suppliers | ||
Borate | Many suppliers | ||
Bromophenol blue | Many suppliers | ||
Dithiothreitol (DTT) | Many suppliers | ||
Electrophoresis system with circulating water bath | Many suppliers | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Many suppliers | ||
Fluoresnence imager, e.g. iBright FL1000 | Thermo Fisher Scientific | A32752 | |
Formamide | Many suppliers | ||
Gel casting system | Many suppliers | ||
Heating block | Many suppliers | ||
Magnesium Chloride | Many suppliers | Other metal ions may be preferred depending on the protein studied | |
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Many suppliers | ||
Micropipettes and tips | Many suppliers | 1 mL, 0.2 mL, 0.02 mL, 0.002 mL | |
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) | Many suppliers | ||
Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | NA | Thermo Fisher, Sigma-Aldrich, Genscript and others also supply these |
pasture pipette | Many suppliers | ||
PCR thermocycler | Many suppliers | ||
PCR tubes | Many suppliers | ||
RNAse away | ThermoFisher | 7002PK | Only needed when working with RNA oligos |
RNase AWAY | Merck | 83931-250ML | Surfactant for removal of RNAse contamination on surfaces |
RNAse-free water | New England Biolabs | B1500L | Only needed when working with RNA oligos |
Sodium Chloride | Many suppliers | ||
SUPERase IN RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | Broad spectrum RNAse inhibitir (protein-based) |
SYBR Gold | Thermo Fisher Scientific | S11494 | This may be used to post-stain gels and visualise unlabelled oligonucleotides |
Tetramethylethylenediamine (TMED) | Many suppliers | ||
Tris, or tris(hydroxymethyl)aminomethane | Many suppliers | ||
Ultrapure water (Milli-Q) | Merck | ||
urea | Many suppliers | ||
Vortex | Many suppliers |