卵巣組織のガラス化のためのプロトコルは、広く使用されているゆっくりと凍結プロトコルに代わる凍結保存方法として、提示されます。
卵巣組織凍結保存(OTC)は、受胎能保存のための重要な選択肢です。性腺毒性治療を延期できない患者や思春期前の少女にとって、それが不妊治療の唯一の選択肢であることがよくあります。凍結保存は、ガラス固化または徐凍結のいずれかによって行うことができます。現在、ゆっくりと凍結することが標準的なアプローチです。ますます多くの研究が、ガラス化が最先端の 体外 受精(IVF)研究所でのゆっくりとした凍結に取って代わることができ、解凍生存率を大幅に改善し、凍結保存の技術的側面を簡素化できることを示しています。臨床ルーチンに適した、卵巣皮質組織の迅速なガラス化のための金属グリッドベースのハイスループットプロトコルについて説明します。金属グリッドと液体窒素の滅菌により、GMP(Good Manufacturing Practice)基準を満たした高品質が保証されます。ガラス固化は、超急速冷却速度を確保するために行われました。ゆっくりと解凍する代わりに、サンプルは急速に温められました。卵胞の生存率を評価するために、カルセイン染色を凍結保存前と急速加温後の両方で行いました。金属グリッドを使用したガラス化と急速な温暖化の成功した適用が報告されています。ガラス固化前と急激な温暖化後に、卵胞の生存率に有意差は観察されませんでした。これらの結果は、広く使用されている低速凍結法の潜在的な代替品として、臨床ルーチンアプリケーションのための組織ガラス化の高能力を実証しています。
卵巣組織の凍結保存は、受胎能の保存にとって重要な選択肢です。卵子が埋め込まれている卵巣卵胞を含む外植組織は凍結保存されます。保管後、卵巣組織を解凍し、温め、患者に再移植することができます。生細胞または生組織には、徐放尿とガラス化の2つの凍結保存方法があります1。
ガラス化は、胚や卵子などの生物学的物質を、緩慢凍結プロトコル1,2,3,4と比較して優れた生存率で保存するために使用されます。ゆっくりと凍結すると、氷の結晶が形成されるなどの制限があり、細胞や組織の構造に損傷を与える可能性があります。しかし、徐放法は生体試料の長期保存を容易にする重要な凍結保存法であり、その機能性は広く証明されています5。ガラス化はガラス状の凝集状態を誘発し、氷の結晶形成を防ぎます6,7。技術レベルでは、ガラス化は、機器のメンテナンスを減らし、技術的なエラーの可能性を減らし、凍結保存プロセスの期間を短縮することにより、凍結保存手順を大幅に簡素化します8,9。女性の生殖能力の保存では、卵巣組織の凍結保存が癌治療前の決定的なアプローチです10。さまざまなグループが、現在標準的なアプローチ15と見なされている緩慢凍結プロトコル11,12,13,14に基づいて、組織の凍結保存、融解、および移植の概念を成功裏に実証しました。
卵巣組織のガラス化は、資源節約22、卵胞生存率、DNA断片化レベル、およびバランスの取れた血管新生能23,24,25,26,27の観点から、有望な代替方法16,17,18,19,20,21と見なされている。これは、日本での納入実績が28件、米国で29件、ドイツでの成功実績が証明しています。
卵巣組織凍結保存(OTC)ガラス化の2つのオプションと、ゆっくりと凍結する標準的な手順を比較することは、現在のメタアナリシス16で部分的に矛盾しています。現在のガラス化プロトコルは大きく異なるため、これにはいくつかの要因が寄与している可能性があります。これらの違いには、凍結保護剤または保護剤の組み合わせの選択、それらの濃度、OTC培地の組成、組織片のサイズ、および組織担体として使用されるデバイスが含まれます。したがって、標準化された温暖化プロトコルはありません。
著者らは、取り扱い、生存率、アポトーシスの開始、血管新生因子の放出、さらには再移植後の出生の報告に関して説得力のある結果をもたらす方法を見つけたため9,27、プロトコルの非常に詳細な説明が提供されます。記載された方法は、卵巣組織のガラス化の標準化に貢献し得る有効かつ効果的なプロトコルを提供する。
ここでは、臨床ルーチンに適したヒト卵巣皮質組織のハイスループットガラス化のためのプロトコルが提示されます。卵母細胞や胚のガラス化と同様に、この手順を成功裏に適用するには、ガラス化溶液と加温溶液の温度、および平衡化期間に関するプロトコルを詳細に遵守する必要があります。空気の質と無菌性に関するEU組織指令37 への準拠も不可欠です。
ガラス化手順は、非結晶性、非晶質、またはガラス状の状態をもたらします。全体として、ガラス化は、さまざまな科学技術領域に大きな影響を与える汎用性の高いプロセスです。ガラス化の主な利点は、組織をガラス状状態に変換する能力であり、それによって氷の結晶形成38,39,40を防ぎ、これは組織の完全性とその成分に悪影響を及ぼす可能性がある。
凍結保護剤(CPA)にポリビニルピロリドン(PVP)を補給すると、ガラス固化溶液の品質を損なうことなくCPA濃度を下げることができる41,42。さらに、金属グリッドの使用は、プラスチックベースのキャリアシステムと比較して高い熱伝導率を提供します。また、グリッド構造により表面の接着が容易になり、組織サンプルや品質測定のための小さなコルテックスパンチの安全で確実な凍結保存が保証されます。他のメーカーのクライオ容器を使用する場合は、事前に金属グリッドのサイズをテストして、クライオ容器の蓋内の安定性と適切なグリップ、および容器への適切なフィット感を確認することが重要です。
ガラス化を成功させるための重要なステップには、滅菌した液体窒素に組織を浸すことによる迅速なガラス化と、悪影響を避けるために遅滞なく急速な加温を行うことが含まれます。費用対効果の面では、組織ガラス化はゆっくりと凍結する手順に比べて要求が少なく、人員の配置計画に影響を与える可能性があります。さらに、ガラス固化により、ゆっくりと凍結するために必要な機器を購入して保守する必要がなくなります。
生物学的測定とメタアナリシスは、ゆっくりと凍結することと比較したガラス化の比較可能性または利点さえも実証しています43。ただし、ガラス化後の結果の違いは、ガラス化デバイスとプロトコルの両方(使用される溶液を含む)が標準化されていないことに起因する可能性があります。将来の研究では、いくつかのグループ44,45,46,47,48,49,50によってマウス卵巣組織で成功裏に実証されたように、ビトリファイド/急速温化組織からの卵胞培養の可能性を探る必要があります。
要約すると、卵巣組織のガラス化は、広く使用されている緩徐凍結プロトコルの重要な代替手段であり、Suzuki51 (日本)、Silber52 (米国)、およびSänger53 (ドイツ)によって報告された5つの成功した送達によってサポートされています。市販のガラス固化培地や細胞用キットとは対照的に、卵巣組織用のFDA/CE承認システムはほとんどなく、臨床現場での応用が制限される可能性があります。したがって、卵巣組織のガラス化と急速な加温のためのFDA/CE承認のキットと培地の開発が推奨されます30。
The authors have nothing to disclose.
校正してくれたCara Färberに感謝します。Katharina Wollersheim氏、Martin Mahlberg氏、Lea Korte氏、Jasmin Rebholz氏の技術協力に感謝します。
1.8 mL vials | VWR International GmbH | 479-6837 | |
10 mL serological pipette | Sarstedt | 86.1254.001 | |
4 well plate | Gynemed | GYOOPW-FW04 | |
50 mL Tube | Sarstedt | 62.559.001 | |
6 well plates | Sarstedt | 83.3920 | |
Bacillol AF | Hartmann | 973385 | |
Calcein AM | Merck | 17783 | |
Collagenase type 1A | Merck | C2674 | |
Cryosure DMSO | WAK Chemie | WAK-DMSO-10 | |
Custodiol | Dr. Franz Köhler Chemie | 00867288 | |
DPBS CTS | Gibco Life technologies | A12856-01 | |
ErgoOne pipette aid | Starlab | S7166-0010 | |
Ethylene glycol | Sigma Aldrich | 102466 | |
Euronda sterilization container | euronda | 282021 | |
G-MOPS+ | Vitrolife | 10130 | |
Metal meshes | Sigma Aldrich | S0770 | |
Metzenbaum scissors | world precision instruments | 501262102 | |
N-Bath System | Nterilizer | N-Bath 3.0 | |
Polyvinylpyrrolidone (PVP) | SAGE | ART-4005 | |
Serum substitute supplement (SSS) | Fujifilm Irvine scientific | 99193 | |
Sterile cup | Sarstedt | 75.562.105 | |
Sterile forceps | Carl Roth | KL05.1 | |
Sucrose | Merck | S0389 |