Es wird ein Protokoll für die Vitrifikation von Ovarialgewebe als Alternative zu dem weit verbreiteten Protokoll des langsamen Einfrierens vorgestellt.
Die Kryokonservierung des Ovarialgewebes (OTC) ist eine wichtige Option zur Erhaltung der Fruchtbarkeit. Für Patientinnen, deren gonadotoxische Behandlungen nicht aufgeschoben werden können, oder für Mädchen vor der Pubertät ist es oft die einzige Option zum Schutz der Fruchtbarkeit. Die Kryokonservierung kann entweder durch Vitrifikation oder durch langsames Einfrieren durchgeführt werden. Slow Freezing ist derzeit der Standardansatz. Eine zunehmende Zahl von Studien deutet darauf hin, dass die Vitrifikation das langsame Einfrieren in den hochmodernen Laboratorien für In-vitro-Fertilisation (IVF) ersetzen kann, wodurch die Überlebensraten beim Auftauen erheblich verbessert und die technischen Aspekte der Kryokonservierung vereinfacht werden. Es wird ein Metallgitter-basiertes Hochdurchsatzprotokoll für die schnelle Vitrifikation von Ovarialrindengewebe beschrieben, das für die klinische Routine geeignet ist. Die Sterilisation von Metallgittern und flüssigem Stickstoff gewährleistet eine hohe Qualität und entspricht den GMP-Standards (Good Manufacturing Practice). Die Verglasung wurde durchgeführt, um ultraschnelle Abkühlraten zu gewährleisten. Anstatt langsam aufzutauen, wurden die Proben schnell erwärmt. Um die Follikelviabilität zu beurteilen, wurde die Calcein-Färbung sowohl vor der Kryokonservierung als auch nach einer schnellen Erwärmung durchgeführt. Es wird über die erfolgreiche Anwendung der Vitrifikation und der schnellen Erwärmung mit Metallgittern berichtet. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Follikelviabilität vor der Vitrifikation und nach einer schnellen Erwärmung beobachtet. Diese Ergebnisse untermauern die hohe Kapazität der Gewebevitrifikation für klinische Routineanwendungen als potenziellen Ersatz für die weit verbreitete Slow-Freeze-Methode.
Die Kryokonservierung von Eierstockgewebe ist eine wichtige Option zur Erhaltung der Fruchtbarkeit. Explantiertes Gewebe mit Ovarialfollikeln, in das Eizellen eingebettet sind, wird kryokonserviert. Nach der Lagerung kann das Eierstockgewebe aufgetaut, erwärmt und der Patientin wieder implantiert werden. Für lebensfähige Zellen oder Gewebe stehen zwei Kryokonservierungsmethoden zur Verfügung: langsames Einfrieren und Vitrifikation1.
Die Vitrifikation wird verwendet, um biologisches Material wie Embryonen und Eizellen zu konservieren, mit überlegenen Überlebensraten im Vergleich zum Protokoll des langsamen Einfrierens 1,2,3,4. Das langsame Einfrieren hat Einschränkungen, wie z. B. die Bildung von Eiskristallen, die Zell- und Gewebestrukturen schädigen können. Das langsame Einfrieren ist jedoch ein wichtiger Kryokonservierungsansatz, der die Langzeitlagerung biologischer Proben erleichtert, und die Funktionalität dieser Methode ist weithin bewiesen5. Die Verglasung induziert einen glasartigen Aggregatzustand, der die Bildung von Eiskristallen verhindert 6,7. Auf technischer Ebene vereinfacht die Vitrifikation das Kryokonservierungsverfahren erheblich, indem sie den Wartungsaufwand der Geräte reduziert, die Wahrscheinlichkeit technischer Fehler verringert und die Dauer des Kryokonservierungsprozesses verkürzt 8,9. Bei der Erhaltung der weiblichen Fruchtbarkeit ist die Kryokonservierung des Ovarialgewebes ein entscheidender Ansatz vor der Krebsbehandlung10. Verschiedene Gruppen haben erfolgreich das Konzept der Kryokonservierung, des Auftauens und der Transplantation von Gewebe auf der Grundlage des langsamen Einfrierprotokolls 11,12,13,14 demonstriert, das derzeit als Standardansatz 15 angesehen wird.
Die Vitrifikation von Eierstockgewebe gilt als vielversprechende alternative Methode 16,17,18,19,20,21 in Bezug auf ressourcenschonende22, follikuläre Überlebensraten, DNA-Fragmentierungsniveaus und ausgewogenes angiogenes Potenzial 23,24,25,26,27. Dies belegen erfolgreiche Auslieferungen in Japan28, USA29 und Deutschland30.
Der Vergleich der beiden Optionen der Kryokonservierung des Ovarialgewebes (OTC)-Vitrifikation mit dem Standardverfahren des langsamen Einfrierens ist in aktuellen Metaanalysen teilweise widersprüchlich16. Mehrere Faktoren könnten dazu beigetragen haben, da die aktuellen Vitrifikationsprotokolle sehr unterschiedlich sind. Zu diesen Unterschieden gehören die Wahl des Kryoprotektivums oder der Kombination von Schutzmitteln, deren Konzentration, die Zusammensetzung der OTC-Medien, die Größe der Gewebefragmente und das als Gewebeträger verwendete Gerät. Dementsprechend gibt es kein standardisiertes Erwärmungsprotokoll.
Da die Autoren eine Methode gefunden haben, die überzeugende Ergebnisse in Bezug auf Handhabung, Lebensfähigkeit, Apoptosebeginn, Freisetzung angiogener Faktoren und sogar einen Bericht über eine Geburt nach Reimplantation liefert 9,27, wird eine sehr detaillierte Beschreibung des Protokolls gegeben. Die beschriebene Methode bietet ein valides und effektives Protokoll, das zur Standardisierung der Vitrifikation von Ovarialgewebe beitragen kann.
Hier wird ein Protokoll für die Hochdurchsatz-Vitrifikation von humanem Ovarialrindengewebe vorgestellt, das für die klinische Routine geeignet ist. Ähnlich wie bei der Vitrifikation von Eizellen oder Embryonen erfordert die erfolgreiche Anwendung des Verfahrens die detaillierte Einhaltung des Protokolls über die Temperatur der Vitrifikations- und Erwärmungslösungen sowie die Äquilibrierungsperiode. Die Einhaltung der EU-Geweberichtlinie37 in Bezug auf Luftqualität und Sterilität ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung.
Das Vitrifikationsverfahren führt zu einem nichtkristallinen, amorphen oder glasartigen Zustand. Insgesamt ist die Vitrifikation ein vielseitiger Prozess mit erheblichen Auswirkungen auf verschiedene wissenschaftliche und technologische Bereiche. Der Hauptvorteil der Vitrifikation besteht in ihrer Fähigkeit, Gewebe in einen glasartigen Zustand umzuwandeln und dadurch die Bildung von Eiskristallen zu verhindern 38,39,40, die die Integrität des Gewebes und seine Bestandteile negativ beeinflussen können.
Die Supplementierung von kryoprotektiven Mitteln (CPAs) mit Polyvinylpyrrolidon (PVP) ermöglicht eine Verringerung der CPA-Konzentration, ohne die Qualität der Vitrifikationslösungen zu beeinträchtigen41,42. Darüber hinaus bietet die Verwendung von Metallgittern eine hohe Wärmeleitfähigkeit im Vergleich zu kunststoffbasierten Trägersystemen. Die Gitterstruktur erleichtert auch die Oberflächenhaftung und gewährleistet so die sichere Kryokonservierung von Gewebeproben und kleinen Kortex-Stanzen für Qualitätsmessungen. Wenn Kryogefäße anderer Hersteller verwendet werden, ist es wichtig, die Größe der Metallgitter vorher zu testen, um die Stabilität und den richtigen Halt im Kryogefäßdeckel sowie einen guten Sitz im Gefäß zu gewährleisten.
Zu den kritischen Schritten für eine erfolgreiche Vitrifikation gehören die schnelle Vitrifikation durch Eintauchen des Gewebes in sterilisierten flüssigen Stickstoff und die schnelle Erwärmung ohne Verzögerung, um nachteilige Ergebnisse zu vermeiden. In Bezug auf die Wirtschaftlichkeit ist die Gewebevitrifikation im Vergleich zum langsamen Einfrieren weniger anspruchsvoll, was die Personaleinsatzplanung beeinflussen kann. Darüber hinaus entfällt durch die Vitrifikation die Notwendigkeit, Geräte zu kaufen und zu warten, die für das langsame Einfrieren erforderlich sind.
Biologische Messungen und Metaanalysen haben die Vergleichbarkeit oder sogar Vorteile der Vitrifikation im Vergleich zum langsamen Einfrieren nachgewiesen43. Unterschiede in den Ergebnissen nach der Vitrifikation können jedoch auf die mangelnde Standardisierung sowohl des Vitrifikationsgeräts als auch des Protokolls zurückgeführt werden, einschließlich der verwendeten Lösungen, die von Studie zu Studie variieren. Zukünftige Forschungen sollten das Potenzial von Follikelkulturen aus vitrifiziertem/schnell erwärmtem Gewebe zur Überwachung des Wachstums in vitro untersuchen, wie es von mehreren Gruppen in Maus-Eierstockgewebe erfolgreich demonstriert wurde 44,45,46,47,48,49,50.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Vitrifizierung von Eierstockgewebe eine bedeutende Alternative zum weit verbreiteten Slow Freezing Protocol ist, unterstützt durch fünf erfolgreiche Geburten, die von Suzuki51 (Japan), Silber52 (USA) und Sänger53 (Deutschland) gemeldet wurden. Im Gegensatz zu kommerziell erhältlichen Vitrifikationsmedien und Kits für Zellen gibt es nur wenige FDA/CE-zugelassene Systeme für Eierstockgewebe, was ihre Anwendung im klinischen Umfeld einschränken kann. Daher wird die Entwicklung von FDA/CE-zugelassenen Kits und Medien für die Vitrifizierung und schnelle Erwärmung von Eierstockgewebe empfohlen30.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Cara Färber für das Korrekturlesen; Katharina Wollersheim, Martin Mahlberg, Lea Korte und Jasmin Rebholz für ihre technische Unterstützung.
1.8 mL vials | VWR International GmbH | 479-6837 | |
10 mL serological pipette | Sarstedt | 86.1254.001 | |
4 well plate | Gynemed | GYOOPW-FW04 | |
50 mL Tube | Sarstedt | 62.559.001 | |
6 well plates | Sarstedt | 83.3920 | |
Bacillol AF | Hartmann | 973385 | |
Calcein AM | Merck | 17783 | |
Collagenase type 1A | Merck | C2674 | |
Cryosure DMSO | WAK Chemie | WAK-DMSO-10 | |
Custodiol | Dr. Franz Köhler Chemie | 00867288 | |
DPBS CTS | Gibco Life technologies | A12856-01 | |
ErgoOne pipette aid | Starlab | S7166-0010 | |
Ethylene glycol | Sigma Aldrich | 102466 | |
Euronda sterilization container | euronda | 282021 | |
G-MOPS+ | Vitrolife | 10130 | |
Metal meshes | Sigma Aldrich | S0770 | |
Metzenbaum scissors | world precision instruments | 501262102 | |
N-Bath System | Nterilizer | N-Bath 3.0 | |
Polyvinylpyrrolidone (PVP) | SAGE | ART-4005 | |
Serum substitute supplement (SSS) | Fujifilm Irvine scientific | 99193 | |
Sterile cup | Sarstedt | 75.562.105 | |
Sterile forceps | Carl Roth | KL05.1 | |
Sucrose | Merck | S0389 |