全血ベースのイムノアッセイは、診断および研究目的で抗原特異的免疫を分析するための簡単でリソース効率の高いツールを提供します。この記事では、真菌およびウイルス性病原体に対する宿主免疫の包括的な分析のための、二重共刺激による最適化された全血ベースのプロトコルを提供します。これには、小児患者および小動物向けの少量バージョンが含まれます。
迅速でリソース効率の高いサンプル処理、ハイスループット、および高い堅牢性は、高度な抗原特異的イムノアッセイの効果的な科学的および臨床的応用にとって重要です。従来、このようなイムノアッセイ、特にフローサイトメトリーや酵素結合免疫吸着スポットアッセイによる抗原特異的T細胞分析は、末梢血単核細胞の単離に頼ることが多いと考えられていました。このプロセスは時間がかかり、多くの分析前の交絡因子の影響を受けやすく、大量の血液を必要とします。全血ベースのアッセイは、分析前の堅牢性を高め、必要な血液量を減らすための簡単な代替手段を提供します。さらに、全血ベースのアッセイでは、単離された細胞サブセットを用いたアッセイでは捕捉されない細胞間相互作用の保存が可能になります。最近、抗原特異的T細胞機能とさまざまな真菌およびウイルス抗原に応答した複雑な細胞間相互作用の両方を包括的に分析するための、二重の抗CD28および抗CD49d共刺激を用いた洗練された全血免疫測定法が提案されています。このプロトコルは、刺激チューブの調製、血液刺激、およびフローサイトメトリー、サイトカイン分泌アッセイ、および転写分析のための下流のサンプル処理に関するガイダンスを提供します。これには、検証済みで機能的に同等で、これまで発表されていない低容量のプロトコル(250 μL)が含まれており、小児患者を対象とした研究や小動物(マウスなど)での研究において、フローサイトメトリーおよびサイトカインベースのT細胞モニタリングをより利用しやすくします。全体として、これらのプロトコルは、臨床研究とトランスレーショナル研究の両方の環境で複雑な抗原特異的免疫分析のための汎用性の高いツールボックスを提供します。
抗原特異的免疫、特に特異的T細胞応答の定量化と特性評価は、免疫生物学やワクチン接種研究、および一部の診断検査にとって極めて重要です。従来、抗原特異的イムノアッセイは、単離された末梢血単核細胞(PBMC)に依存するのが一般的でした。しかし、これらの細胞の単離には時間と資源が大量にかかり、多くの場合、比較的大量の血液が必要です。さらに、分析前保管中の顆粒球の活性化とそれに続くT細胞の乱れを防ぐためには、サンプルの迅速な処理が最も重要ですが、これは臨床現場では実現できないことがよくあります。これらの制限は、ハイスループット研究のシナリオや臨床ルーチンにおける抗原特異的イムノアッセイの実用性を妨げます。そのため、近年、使いやすく自動化可能な全血ベースのアプローチの開発により、イムノアッセイアプリケーションの新しい領域が開かれています。しかし、現在市販されているシステムは通常、T細胞にとって最適な共刺激環境を欠いており、分析前の遅延の影響を受けやすいです。例えば、広く使用されている全血ベースのIFN-γ放出アッセイは、分析前の血液保存の6時間後に19%の陽性から陰性の復帰率を示しています2。これらの制限を克服するために、二重の抗CD28および抗CD49d共刺激による最適化されたプロトコルが開発された3,4,5,6。
ここで紹介するプロトコールは、抗原特異的T細胞の正確で再現性のある定量と特性評価、抗原誘発性サイトカイン応答の評価、およびその他の(フローサイトメトリーまたは転写)機能免疫マーカーを最小限の血液量、すなわち刺激チューブあたり500μLから可能にします。このプロトコルのさらなる利点には、ハンズオン時間が短いこと、分析前の交絡因子に対する高い回復力、および比較的生理学的な ex vivo 環境での機能的な細胞間相互作用の保存が含まれます。全血フローサイトメトリー抗原特異的T細胞の特性評価と、従来のPBMCベースのアッセイから生成されたデータの比較可能性は、以前にカビ特異的T細胞定量の文脈で示されています6。さらに、被験者の血液を直接刺激することで、最適なPBMC刺激に一般的に必要とされる自家血清、同種血清、さらには異種血清の補給の必要性がなくなります。また、細胞単離を省略することで、せん断ストレスや温度ストレスが軽減され、細胞の生存率が向上します。最も重要なことは、全血ベースのアッセイは、PBMCの単離のための勾配遠心分離中に失われた顆粒球集団を保存することです7。これにより、このアッセイセットアップは、顆粒球と単核細胞との間の機能的相互作用ループを保存および捕捉します4。
注目すべきは、このプロトコルは、異なる読み出しモダリティに対応するために最小限の変更しか必要とせず、同じ刺激チューブからのサイトカイン放出と転写応答の二重分析さえ可能にすることです。具体的には、刺激後に培養上清からサイトカインを解析する一方で、細胞ペレットをRNA単離に用い、その後のトランスクリプトーム解析に用いることができます。さまざまな読み出しモダリティの一般的なワークフローを 図 1 にまとめます。
近年、研究や臨床現場での病原体反応性免疫モニタリングのために、結核菌8,9、百日咳菌3、Orientia tsutsugamushi10、SARS-CoV-2 5,11,12など、全血ベースのアッセイが開発されています。例えば、以前に確立されたシステムは、結核菌、インフルエンザAウイルス、およびSARS-CoV-2を含む複数の抗原に使用されてきたが、Tヘルパー(Th)細胞刺激13,14,15に最適化された共刺激因子を使用していない。これらのアッセイに必要な血液量は、従来のPBMCベースのアッセイや市販の全血刺激キットに使用される血液量よりもすでに大幅に少なくなっていますが、小児科、新生児科、集中治療室(ICU)の患者、および小動物モデルでの前臨床研究への応用には、さらに少ないサンプル量が保証される可能性があります。例えば、マウスからの終末採血(心臓穿刺など)でも、一般的に最大0.7〜1mLの血液が得られます。したがって、刺激チューブあたり250μLの血液量からの抗原反応性T細胞応答の正確な定量化および特性評価のために、以前に確立された全血ベースの免疫測定プロトコル4,6をさらにダウンスケールする可能性が、このプロトコルの一部として評価されています。
抗原特異的イムノアッセイは、宿主と微生物の相互作用に関する洞察を提供し、ワクチン接種および免疫療法の研究にとって極めて重要であり、日和見感染症患者の診断および予後診断法としてますます認識されるようになっています35。このプロトコルは、最小限の血液量(抗原あたり250-500μL)を使用して抗原特異的免疫の堅牢でマルチモーダルな分析を可能にする簡単な抗原刺激システムについて説明しています。250 μLのプロトコルを縮小した結果、以前に確立された500 μLのプロトコルと比較して、抗原特異的なT細胞の頻度、表現型、およびサイトカイン産生の相関が良好に示されました。サンプル処理36のいくつかのステップで少量の溶液が利用可能であるにもかかわらず、著者の知る限り、現在利用可能な市販のシステムは、フローサイトメトリー、サイトカイン放出アッセイ、および250〜500μLの血液量からのトランスクリプトミクスによるT細胞駆動型機能免疫応答の抗原刺激および多面的な機能解析を確実にサポートできるものではない。同様の研究アプリケーションの範囲を促進する最も広く使用されている商用システムは、3mLの刺激環境で1mLの血液量を使用するため、ここで提示したプロトコル13,14,15と比較して、必要な抗原のコストと量がかなり高くなります。
抗原特異的T細胞6,37,38のフローサイトメトリー定量のための全血ベースのプロトコルの継続的な最適化にもかかわらず、フローサイトメトリー測定にはいくつかの欠点があります。特に、それらは本質的に手間がかかり、オペレーター間の大きなばらつき(主観的なゲートプロセスなど)や、ラボ間で機器のセットアップ、補正プロトコル、および取得パラメータが異なるため、標準化が困難です。標準化された報告39および自動解析およびゲーティングソフトウェアの使用は、ますます複雑化するマルチカラーデータセット40,41の標準化および比較可能性を改善するかもしれないが、ここで説明する刺激プロトコルは、種々の非フローサイトメトリー読み出しモダリティに対応するように設計されている。
特に、サイトカイン放出アッセイは、手軽なハンズオン時間と比較的安価な機器で実施でき、多くの場合、日常的な臨床アプリケーション向けに容易に標準化されています。さらに、このプロトコルを使用した以前の研究で示されたように、最新のマルチプレックスアッセイでは、最小限のサンプル量から多数のサイトカイン応答を測定できるため、研究環境での複雑なサイトカインシグネチャーのプロファイリングが可能になります24,42。注目すべきは、二重共刺激によるこの堅牢なプロトコルにより、非リンパ球症患者(>800リンパ球/μL血液)における抗原特異的サイトカイン応答の信頼性の高い定量化が容易になることです。医原性免疫抑制を受けている患者でも26,34。サイトカイン放出アッセイの欠点として、特に白血球減少症の患者では、分泌されたサイトカインを個々の細胞集団に追跡することができません。場合によっては、細胞特異的な刺激(利用可能な場合)を使用することで、これを軽減できる場合があります。ただし、サイトカイン濃度と他の読み取りモダリティとの組み合わせ、および/または臨床血液学に基づくサイトカイン応答の調整(すなわち、白血球分化を伴う全血球計算)が必要になる場合があります。特に、ここで紹介するプロトコールでは、同じサンプルからのサイトカインの読み出しと転写シグネチャーの組み合わせが可能であるため、グローバルサイトカインシグネチャーに細胞のコンテキストと特異性を追加できる可能性のある明確に定義された転写活性化マーカーの一致した解析が可能になります。
完全な標準化とさらに優れた臨床実践性に向けた将来のステップは、サンプル処理から分析物の読み取りまで、これらのアッセイを完全に自動化することです。個々の細胞集団の正確な自動単離が成功裏に確立されているにもかかわらず43,44、抗原特異的T細胞解析では、実験室の担当者が断続的な取り扱い手順を踏む必要があります。しかし、細胞の単離や脆弱なPBMCの取り扱いを省略し、市販の自動化に対応した刺激チューブを使用することで、機能的なイムノアッセイのためのシンプルで完全に自動化された全血ベースのワークフローの実施が容易になるかもしれません。
全体として、本明細書で紹介されているような汎用性の高い全血ベースのプロトコルは、抗原特異的機能免疫測定法のアプリケーションを、小動物での前臨床試験を含む新しい患者コホートや研究分野に拡大する大きな可能性を秘めています。抗原特異的な機能的免疫測定法は、現在、マウスモデルではほとんど実行不可能であり、数匹の動物からの血液のプールや、脾細胞などの標準化されていない細胞抽出物の使用が必要です。日和見感染に対する宿主防御力を高めるための免疫療法的介入(免疫チェックポイント阻害剤、造血増殖因子、サイトカインなど)への関心の高まりや、革新的なワクチン接種技術の急増を考えると、抗原特異的機能免疫測定法は、前臨床感染症の研究と多様な患者集団における臨床応用の両方でますます重要な役割を果たすことが期待されています。ここで紹介する堅牢で安価、使いやすく、少量の抗原刺激システムは、未開拓の領域での包括的な抗原特異的免疫解析を促進する可能性があります。さらに、この簡便なプロトコルの解析前の堅牢性により、イムノアッセイアプリケーションを臨床ルーチンに適切に組み込む機会が生まれ、パーソナライズされたバイオマーカー主導の感染症管理に一歩近づくことができるかもしれません。
The authors have nothing to disclose.
血清抗体測定を実施してくださったアウグスブルク大学病院臨床医学微生物研究所の臨床化学および感染血清学部門に感謝します。トランスクリプトミクス施設を提供してくださったFriederike Liesche-Starnecker博士とアウグスブルク大学病院の病理学・分子診断研究所に感謝します。アウグスブルク大学病院のMarie Freitag氏には、ワクチン接種のロジスティクスとサンプル取得をサポートしていただいたことに感謝します。オラフ・クニーマイヤー博士とドイツのイェーナにあるハンス・クノール研究所に 、Aspergillus fumigatus lysateを提供していただいたことに感謝します。この研究は、研究イニシアチブBay-VOC(資金番号GE2-2452-200-D37666/2022)、バイエルン州科学芸術省、およびドイツのアウグスブルク大学が支援しました。
7-AAD Solution | Miltenyi Biotec | 130-111-568 | |
Anti-IFN-g-PE, human, REA600, 100 tests | Miltenyi Biotec | 130-113-498 | |
Aspergillus fumigatus lysate | N/A | N/A | Kindly provided by the Hans-Knoell Institute Jena, Germany |
Brilliant Violet 650 anti-human CD197 (CCR7) Antibody | BioLegend | 353234 | |
Buffer EL | Qiagen | 79217 | Erythrocyte lysis buffer |
CD154-PE-Vio770, human, REA238, 100 tests | Miltenyi Biotec | 130-113-614 | |
CD279 (PD1)-VioBright 515, human, 100 tests | Miltenyi Biotec | 130-120-386 | |
CD28 pure, human – functional grade | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | |
CD3-VioBright R720, human, REA613, 100 tests | Miltenyi Biotec | 130-127-377 | |
CD45RO-APC-Vio770, human, REA611, 100 tests | Miltenyi Biotec | 130-113-557 | |
CD49d pure, human | Miltenyi Biotec | 130-093-279 | |
CD4-VioBlue, human, REA623, 100 tests | Miltenyi Biotec | 130-114-534 | |
CD69-PE-Vio615, human, REA824, 100 tests | Miltenyi Biotec | 130-112-617 | |
CO2 Incubator | PHCbi | MCO-170AICD-PE | |
CPI Positive Control Solution | ImmunoSpot | CTL-CPI-001 | |
CRX-527 | Invivogen | tlrl-crx527 | |
CytExpert Acquisition and Analysis Software | Beckman Coulter | Version 2.4 | Flow cytometer operating softwware |
CytoFlex S B2-R3-V4-Y4 | Beckman Coulter | B75408 | Flow cytometer |
GraphPad Prism | GraphPad | Version 10.1.0 | |
Herpes simplex virus 1 lysate | AID Autoimmun Diagnostika | ELSP 5916K | |
HU IFN G Uncoated ELISA 2X96T PLT | Thermo Fisher Scientific | 88-7316-22 | |
HydroFLex Microplate Washer | Tecan | 30220085 | |
Infinite M Plex | Tecan | 30213614 | Multimode Microplate Reader |
Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | Version 2.1.00003.20057 | Flow cytometric data analysis software |
MACS Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | |
Mastercycler X50l | Eppendorf | 6303000010 | |
Nanodrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
nCounter Sprint Cartridge | Nanostring | 100078 | |
nCounter Sprint Profiler | Nanostring | 100170 | |
nCounter Sprint Reagent Pack | Nanostring | 100077 | |
nSolver | Nanostring | Version 4.0 | Nanostring nCounter data analysis software |
Octeniderm farblos 250 ml FL | Schuelke | 118211 | |
Omnifix F Solo, 1 ml, ohne Kanüle, 3-teilig | Braun | 9161406V | Syringes |
PepTivator CMV pp65, human, 60nmol | Miltenyi Biotec | 130-093-435 | |
PepTivator SARS-CoV-2 Prot_S, research grade, for stimulation of 1×108 cells | Miltenyi Biotec | 130-126-700 | |
QIAshredder | Qiagen | 79654 | |
RNA Protect | Qiagen | 76526 | |
RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 72400047 | |
Safe 2020 1.5 Microbiological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51026959 | |
S-Monovette lithium-heparin, 4.9 ml | Sarstedt | 04.1939.001 | Blood collection tubes |
S-Monovette neutral, 2.7 ml | Sarstedt | 05.1729 | Stimulation environment tubes |
Sterican Safety G 19 x 1 1/2'' 1,1 x 40 mm | Braun | 4670052S-01 | Needles |
Stop Solution, 100 ML | Thermo Fisher Scientific | BMS409.0100 | |
Wash Buffer 20X, 500 ML | Thermo Fisher Scientific | BMS408.0500 | |
Water, 1 l | Carl Roth | 3478.1 | |
XT Hs Exhaustion CSO | Nanostring | 115000466 | Nanostring Immune Exhaustion Panel |