Vollblutbasierte Immunoassays bieten ein einfaches und ressourceneffizientes Werkzeug zur Analyse der antigenspezifischen Immunität für Diagnose- und Forschungszwecke. Dieser Artikel bietet ein optimiertes Vollblut-basiertes Protokoll mit dualer Co-Stimulation für eine umfassende Analyse der Immunität des Wirts gegen pilzliche und virale Krankheitserreger, einschließlich einer Version mit geringem Volumen für pädiatrische Patienten und Kleintiere.
Eine schnelle und ressourceneffiziente Probenverarbeitung, ein hoher Durchsatz und eine hohe Robustheit sind entscheidend für eine effektive wissenschaftliche und klinische Anwendung fortschrittlicher antigenspezifischer Immunoassays. Traditionell beruhen solche Immunoassays, insbesondere die antigenspezifische T-Zell-Analyse mittels Durchflusszytometrie oder enzymgebundene Immunsorbent-Spot-Assays, häufig auf der Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes. Dieser Prozess ist zeitaufwändig, unterliegt vielen präanalytischen Störfaktoren und erfordert große Blutmengen. Vollblutbasierte Assays bieten eine einfache Alternative mit erhöhter präanalytischer Robustheit und geringeren Anforderungen an das Blutvolumen. Darüber hinaus ermöglichen Vollblut-basierte Assays die Konservierung interzellulärer Interaktionen, die von Assays mit isolierten Zelluntergruppen nicht erfasst werden. Kürzlich wurde ein verfeinerter Vollblut-Immunoassay mit dualer anti-CD28- und anti-CD49d-Co-Stimulation für eine umfassende Analyse sowohl antigenspezifischer T-Zell-Funktionen als auch komplexer interzellulärer Wechselwirkungen als Reaktion auf verschiedene pilzliche und virale Antigene vorgeschlagen. Dieses Protokoll bietet eine Anleitung für die Vorbereitung von Stimulationsröhrchen, die Blutstimulation und die nachgelagerte Probenverarbeitung für die Durchflusszytometrie, Zytokinsekretionsassays und Transkriptionsanalysen. Dazu gehört ein validiertes und funktionell äquivalentes, bisher unveröffentlichtes Protokoll mit geringem Volumen (250 μl), um das durchflusszytometrische und zytokinbasierte T-Zell-Monitoring für Studien an pädiatrischen Patienten oder präklinische Studien an Kleintieren (z. B. Mäusen) zugänglicher zu machen. Insgesamt bieten diese Protokolle einen vielseitigen Werkzeugkasten für die komplexe antigenspezifische Immunanalyse sowohl in der klinischen als auch in der translationalen Forschung.
Die Quantifizierung und Charakterisierung der antigenspezifischen Immunität, insbesondere der spezifischen T-Zell-Antworten, ist für die Immunbiologie und Impfforschung sowie für einige diagnostische Tests von zentraler Bedeutung. Traditionell stützten sich antigenspezifische Immunoassays häufig auf isolierte mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs). Die Isolierung dieser Zellen ist jedoch zeit- und ressourcenintensiv und erfordert oft relativ große Blutmengen. Um die Aktivierung von Granulozyten und die anschließende Störung der T-Zellen während der präanalytischen Lagerung1 zu verhindern, ist außerdem eine schnelle Verarbeitung der Proben von größter Bedeutung, die in der klinischen Praxis oft nicht durchführbar ist. Diese Einschränkungen behindern die Praktikabilität antigenspezifischer Immunoassays in Hochdurchsatz-Forschungsszenarien und klinischen Routinen. Daher hat die Entwicklung von einfach zu handhabenden und potenziell automatisierbaren Vollblut-basierten Ansätzen in den letzten Jahren neue Anwendungsbereiche für Immunoassays eröffnet. Den derzeit kommerziell erhältlichen Systemen fehlen jedoch in der Regel optimale co-stimulatorische Umgebungen für T-Zellen und sie sind anfällig für präanalytische Verzögerungen. Zum Beispiel hat ein weit verbreiteter Vollblut-basierter IFN-γ-Freisetzungsassay eine positive zu negative Reversionsrate von 19 % nach 6 Stunden präanalytischer Blutlagerung2. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden optimierte Protokolle mit dualer Anti-CD28- und Anti-CD49d-Co-Stimulation entwickelt 3,4,5,6.
Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht eine genaue und reproduzierbare Quantifizierung und Charakterisierung von antigenspezifischen T-Zellen, die Bewertung von Antigen-induzierten Zytokinantworten und andere (durchflusszytometrische oder transkriptionelle) funktionelle Immunmarker aus einem minimalen Blutvolumen, d.h. 500 μL Blut pro Stimulationsröhrchen. Zu den weiteren Vorteilen dieses Protokolls gehören die geringe Hands-on-Zeit, die hohe Resilienz gegenüber präanalytischen Störfaktoren und die Erhaltung funktioneller interzellulärer Interaktionen in einer relativ physiologischen ex vivo-Umgebung . Die Vergleichbarkeit der vollblutbasierten durchflusszytometrischen antigenspezifischen T-Zell-Charakterisierung mit Daten, die aus herkömmlichen PBMC-basierten Assays gewonnen wurden, wurde bereits im Rahmen der moldspezifischen T-Zell-Quantifizierung gezeigt6. Darüber hinaus entfällt durch die direkte Stimulation des Blutes der Probanden die Notwendigkeit einer Supplementierung mit autolom, allogenem oder sogar xenogenem Serum, das üblicherweise für eine optimale PBMC-Stimulation erforderlich ist. Der Wegfall der Zellisolierung reduziert auch die Scher- und Temperaturbelastung und verbessert dadurch die Lebensfähigkeit der Zelle. Am wichtigsten ist, dass Vollblut-basierte Assays Granulozytenpopulationen erhalten, die während der Gradientenzentrifugation für die Isolierung von PBMCs verloren gehen7. Dabei werden bei diesem Assay-Aufbau funktionelle Interaktionsschleifen zwischen Granulozyten und mononukleären Zellen erhalten und erfasst4.
Bemerkenswert ist, dass dieses Protokoll nur minimale Modifikationen erfordert, um unterschiedliche Auslesemodalitäten zu berücksichtigen, und sogar eine duale Analyse der Zytokinfreisetzung und der Transkriptionsreaktionen von derselben Stimulationsröhre ermöglicht. Während Zytokine nach der Stimulation aus dem Kulturüberstand analysiert werden, kann das Zellpellet für die RNA-Isolierung mit anschließender transkriptomischer Analyse verwendet werden. Der allgemeine Arbeitsablauf für die verschiedenen Auslesemodalitäten ist in Abbildung 1 zusammengefasst.
In den letzten Jahren wurde eine zunehmende Anzahl von Vollblut-basierten Assays für das pathogen-reaktive Immunmonitoring in Forschung und Klinik entwickelt, z. B. für Mycobacterium tuberculosis 8,9, Bordetella pertussis3, Orientia tsutsugamushi10 und SARS-CoV-2 5,11,12. Zum Beispiel wurde ein zuvor etabliertes System für mehrere Antigene verwendet, darunter M. tuberculosis, Influenza-A-Virus und SARS-CoV-2, verwendet jedoch keine co-stimulatorischen Faktoren, die für die Stimulation von T-Helfer (Th)-Zellen optimiert sind 13,14,15. Auch wenn das für diese Assays erforderliche Blutvolumen bereits deutlich geringer ist als das für herkömmliche PBMC-basierte Assays oder kommerziell erhältliche Vollblutstimulationskits, könnte ein noch kleineres Probenvolumen für Anwendungen in der Pädiatrie, Neonatologie, bei Patienten auf der Intensivstation (ICU) und in der präklinischen Forschung in Kleintiermodellen gerechtfertigt sein. Zum Beispiel ergibt selbst die terminale Blutentnahme von Mäusen (z. B. durch Herzpunktion) in der Regel ein Maximum von 0,7-1 ml Blut. Daher wurde im Rahmen dieses Protokolls die Möglichkeit evaluiert, zuvor etablierte Vollblut-basierte Immunoassay-Protokolle 4,6 zur präzisen Quantifizierung und Charakterisierung von antigen-reaktiven T-Zell-Antworten ab 250 μl Blutvolumen pro Stimulationsröhrchen weiter herunterzuskalieren.
Antigenspezifische Immunoassays geben Einblicke in Wirt-Mikroben-Interaktionen, sind für die Impf- und Immuntherapieforschung von zentraler Bedeutung und werden zunehmend als diagnostische und prognostische Modalitäten bei Patienten mit opportunistischen Infektionen anerkannt35. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Antigenstimulationssystem, das eine robuste und multimodale Analyse der antigenspezifischen Immunität mit minimalen Blutvolumina (250-500 μL pro Antigen) ermöglicht. Das verkleinerte 250-μl-Protokoll ergab eine hervorragende Korrelation von antigenspezifischen T-Zell-Frequenzen, Phänotypen und Zytokinproduktion im Vergleich zum zuvor etablierten 500-μl-Protokoll. Trotz der Verfügbarkeit von Lösungen mit kleinem Volumen für einige Schritte der Probenverarbeitung36 kann nach Kenntnis der Autoren kein derzeit verfügbares kommerzielles System die Antigenstimulation und die facettenreiche funktionelle Analyse von T-Zell-gesteuerten funktionellen Immunantworten durch Durchflusszytometrie, Zytokinfreisetzungsassays und Transkriptomik aus Blutvolumina von 250-500 μl zuverlässig unterstützen. Das am weitesten verbreitete kommerzielle System, das ein ähnliches Spektrum von Forschungsanwendungen ermöglicht, verwendet ein Blutvolumen von 1 ml in einer Stimulationsumgebung von 3 ml, was zu erheblich höheren Kosten und Mengen an benötigten Antigenen im Vergleich zu dem hier vorgestellten Protokoll führt 13,14,15.
Trotz kontinuierlicher Optimierung von Vollblut-basierten Protokollen für die durchflusszytometrische Quantifizierung von antigenspezifischen T-Zellen 6,37,38 haben durchflusszytometrische Messungen mehrere Nachteile. Insbesondere sind sie nach wie vor aufwendig und aufgrund der erheblichen Variabilität zwischen den Bedienern (z. B. des subjektiven Gating-Prozesses) und der unterschiedlichen Gerätekonfigurationen, Kompensationsprotokolle und Erfassungsparameter zwischen den Labors schwer zu standardisieren. Obwohl eine standardisierte Befundung39 und die Verwendung automatisierter Analyse- und Gating-Software die Standardisierung und Vergleichbarkeit von zunehmend komplexeren mehrfarbigen Datensätzen 40,41 verbessern könnten, wurde das hier beschriebene Stimulationsprotokoll so konzipiert, dass es verschiedene nicht-durchflusszytometrische Auslesemodalitäten aufnehmen kann.
Insbesondere Zytokinfreisetzungsassays können mit geringem Zeitaufwand und relativ kostengünstigen Geräten durchgeführt werden und sind für klinische Routineanwendungen oft leicht standardisiert. Darüber hinaus kann, wie in früheren Studien mit diesem Protokoll gezeigt wurde, mit modernen Multiplex-Assays eine Vielzahl von Zytokinantworten aus minimalen Probenvolumina gemessen werden, was eine Profilerstellung komplexer Zytokinsignaturen in Forschungsumgebungen ermöglicht24,42. Bemerkenswert ist, dass dieses robuste Protokoll mit dualer Co-Stimulation eine zuverlässige Quantifizierung antigenspezifischer Zytokinantworten bei nicht-lymphopenischen Patienten (>800 Lymphozyten/μl Blut) ermöglicht, selbst bei Patienten, die iatrogene Immunsuppression erhalten26,34. Ein Nachteil von Zytokin-Release-Assays, insbesondere bei Patienten mit Leukopenie, ist, dass sekretierte Zytokine nicht auf einzelne Zellpopulationen zurückgeführt werden können. In einigen Fällen kann dies durch den Einsatz von zellspezifischen Stimuli gemildert werden, sofern verfügbar. Eine Kombination der Zytokinkonzentrationen mit anderen Auslesemodalitäten und/oder eine Anpassung der Zytokinantworten auf der Grundlage der klinischen Hämatologie (d. h. vollständiges Blutbild mit Leukozytendifferenzierung) kann jedoch erforderlich sein. Insbesondere ermöglicht das hier vorgestellte Protokoll eine Kombination von Zytokinauslesungen und transkriptionellen Signaturen aus derselben Probe, wodurch eine konkordante Analyse von gut definierten transkriptionellen Aktivierungsmarkern ermöglicht wird, die den globalen Zytokinsignaturen einen zellulären Kontext und Spezifität hinzufügen könnten.
Ein zukünftiger Schritt hin zu einer vollständigen Standardisierung und noch besseren klinischen Praktikabilität wäre die vollständige Automatisierung dieser Assays von der Probenverarbeitung bis zur Analytauslesung. Auch wenn die präzise automatisierte Isolierung einzelner Zellpopulationen erfolgreich etabliert wurde43,44, erfordert die antigenspezifische T-Zell-Analyse immer noch intermittierende Handgriffe durch das Laborpersonal. Der Wegfall der Zellisolierung und des Umgangs mit anfälligen PBMC sowie die Verwendung kommerzieller, automatisierungsfähiger Stimulationsröhrchen könnten jedoch die Implementierung einfacher, vollautomatischer Vollblut-basierter Arbeitsabläufe für funktionelle Immunoassays erleichtern.
Insgesamt bergen vielseitige Vollblut-basierte Protokolle, wie das hierin vorgestellte, ein erhebliches Versprechen, die Anwendungen von antigenspezifischen funktionellen Immunoassays auf neue Patientenkohorten und Forschungsbereiche auszuweiten, einschließlich präklinischer Studien an Kleintieren. Antigenspezifische funktionelle Immunoassays sind in Mausmodellen derzeit weitgehend nicht durchführbar oder erfordern das Pooling von Blut mehrerer Tiere und/oder die Verwendung von nicht standardisierten Zellextrakten wie z.B. Splenozyten. Angesichts des wachsenden Interesses an immuntherapeutischen Interventionen zur Stärkung der Wirtsabwehr gegen opportunistische Infektionen (z. B. Immun-Checkpoint-Inhibitoren, hämatopoetische Wachstumsfaktoren, Zytokine usw.) und des Anstiegs innovativer Impftechnologien wird erwartet, dass antigenspezifische funktionelle Immunoassays eine zunehmende Rolle sowohl in der präklinischen Erforschung von Infektionskrankheiten als auch in der klinischen Anwendung in verschiedenen Patientenpopulationen spielen werden. Das hier vorgestellte robuste, kostengünstige und einfach zu bedienende Antigenstimulationssystem mit geringem Volumen kann umfassende antigenspezifische Immunanalysen in unerschlossenen Bereichen ermöglichen. Darüber hinaus könnte die präanalytische Robustheit dieses einfachen Protokolls Möglichkeiten für eine verbesserte Integration von Immunoassay-Anwendungen in die klinische Routine schaffen, die es uns ermöglicht, einem personalisierten, biomarkergesteuerten Management von Infektionskrankheiten einen Schritt näher zu kommen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken den Abteilungen Klinische Chemie und Infektionsserologie am Institut für Laboratoriumsmedizin und Mikrobiologie des Universitätsklinikums Augsburg für die Durchführung der Serum-Antikörpermessungen. Wir danken Dr. Friederike Liesche-Starnecker und dem Institut für Pathologie und Molekulare Diagnostik des Universitätsklinikums Augsburg für die Bereitstellung von Transkriptomik-Einrichtungen. Wir danken Marie Freitag vom Universitätsklinikum Augsburg für die Unterstützung bei der Impflogistik und der Probenbeschaffung. Wir danken Dr. Olaf Kniemeyer und dem Hans-Knöll-Institut in Jena für die Bereitstellung von Aspergillus fumigatus lysat. Die Forschungsinitiative Bay-VOC (Förderkennzeichen GE2-2452-200-D37666/2022), das Bayerische Staatsministerium für Wissenschaft und Kunst sowie die Universität Augsburg unterstützten diese Arbeiten.
7-AAD Solution | Miltenyi Biotec | 130-111-568 | |
Anti-IFN-g-PE, human, REA600, 100 tests | Miltenyi Biotec | 130-113-498 | |
Aspergillus fumigatus lysate | N/A | N/A | Kindly provided by the Hans-Knoell Institute Jena, Germany |
Brilliant Violet 650 anti-human CD197 (CCR7) Antibody | BioLegend | 353234 | |
Buffer EL | Qiagen | 79217 | Erythrocyte lysis buffer |
CD154-PE-Vio770, human, REA238, 100 tests | Miltenyi Biotec | 130-113-614 | |
CD279 (PD1)-VioBright 515, human, 100 tests | Miltenyi Biotec | 130-120-386 | |
CD28 pure, human – functional grade | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | |
CD3-VioBright R720, human, REA613, 100 tests | Miltenyi Biotec | 130-127-377 | |
CD45RO-APC-Vio770, human, REA611, 100 tests | Miltenyi Biotec | 130-113-557 | |
CD49d pure, human | Miltenyi Biotec | 130-093-279 | |
CD4-VioBlue, human, REA623, 100 tests | Miltenyi Biotec | 130-114-534 | |
CD69-PE-Vio615, human, REA824, 100 tests | Miltenyi Biotec | 130-112-617 | |
CO2 Incubator | PHCbi | MCO-170AICD-PE | |
CPI Positive Control Solution | ImmunoSpot | CTL-CPI-001 | |
CRX-527 | Invivogen | tlrl-crx527 | |
CytExpert Acquisition and Analysis Software | Beckman Coulter | Version 2.4 | Flow cytometer operating softwware |
CytoFlex S B2-R3-V4-Y4 | Beckman Coulter | B75408 | Flow cytometer |
GraphPad Prism | GraphPad | Version 10.1.0 | |
Herpes simplex virus 1 lysate | AID Autoimmun Diagnostika | ELSP 5916K | |
HU IFN G Uncoated ELISA 2X96T PLT | Thermo Fisher Scientific | 88-7316-22 | |
HydroFLex Microplate Washer | Tecan | 30220085 | |
Infinite M Plex | Tecan | 30213614 | Multimode Microplate Reader |
Kaluza Analysis Software | Beckman Coulter | Version 2.1.00003.20057 | Flow cytometric data analysis software |
MACS Inside Stain Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-477 | |
Mastercycler X50l | Eppendorf | 6303000010 | |
Nanodrop One | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
nCounter Sprint Cartridge | Nanostring | 100078 | |
nCounter Sprint Profiler | Nanostring | 100170 | |
nCounter Sprint Reagent Pack | Nanostring | 100077 | |
nSolver | Nanostring | Version 4.0 | Nanostring nCounter data analysis software |
Octeniderm farblos 250 ml FL | Schuelke | 118211 | |
Omnifix F Solo, 1 ml, ohne Kanüle, 3-teilig | Braun | 9161406V | Syringes |
PepTivator CMV pp65, human, 60nmol | Miltenyi Biotec | 130-093-435 | |
PepTivator SARS-CoV-2 Prot_S, research grade, for stimulation of 1×108 cells | Miltenyi Biotec | 130-126-700 | |
QIAshredder | Qiagen | 79654 | |
RNA Protect | Qiagen | 76526 | |
RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement, HEPES | Thermo Fisher Scientific | 72400047 | |
Safe 2020 1.5 Microbiological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 51026959 | |
S-Monovette lithium-heparin, 4.9 ml | Sarstedt | 04.1939.001 | Blood collection tubes |
S-Monovette neutral, 2.7 ml | Sarstedt | 05.1729 | Stimulation environment tubes |
Sterican Safety G 19 x 1 1/2'' 1,1 x 40 mm | Braun | 4670052S-01 | Needles |
Stop Solution, 100 ML | Thermo Fisher Scientific | BMS409.0100 | |
Wash Buffer 20X, 500 ML | Thermo Fisher Scientific | BMS408.0500 | |
Water, 1 l | Carl Roth | 3478.1 | |
XT Hs Exhaustion CSO | Nanostring | 115000466 | Nanostring Immune Exhaustion Panel |