Количественная оценка дендритных отростков с помощью программного обеспечения для автоматической трехмерной реконструкции нейронов

Дендритные шипики представляют собой выступы дендритов, часто составляющие постсинаптический участок глутаматергических синапсов ^1,2. Дендритные шипики представляют особый интерес в области синаптической пластичности. Позвоночники часто изменяются при изменении синаптической силы, становясь больше и сильнее при длительной синаптической потенциации или меньше и слабее при долгосрочной синаптической депрессии 3,4,5,6,7. Помимо синаптической пластичности, профиль дендритных шипиков меняется на протяжении всей жизни. На ранних этапах развития наступает период формирования и роста дендритных шипов, за которым следует обрезка дендритных шипиков до достижения устойчивого состояния ^8,9,10. В стареющем мозге потеря позвоночника сопровождается уменьшением мозга и снижением когнитивных^{функций11}. Кроме того, многие неврологические, нейродегенеративные и психические расстройства характеризуются аберрантными дендритными шипами. Множественные области мозга у людей, страдающих шизофренией, имеют меньшее количество дендритных шипиков, что, вероятно, является результатом измененной синаптической^{обрезки.} Расстройства аутистического спектра также характеризуются дендритными патологиями позвоночника¹³. Дендритная потеря позвоночника является отличительной чертой как болезни Альцгеймера, так и болезни Паркинсона^14,15. Учитывая широкий спектр тем исследований, охватывающих изучение свойств дендритного шипа, методы точного количественного определения шипиков имеют первостепенное значение.

Окрашивание, т.е. метод Гольджи, или мечение нейронов с помощью наполнения красителя или экспрессии флуоресцентных белков являются распространенными методами визуализации дендритного позвоночника 16,17,18. После визуализации шипы могут быть проанализированы с помощью различных бесплатных и коммерчески доступных программных клиентов. Желаемые результаты анализа являются важным фактором при определении того, какое программное обеспечение будет наиболее полезным. Fiji — это жизнеспособный вариант программного обеспечения для вопросов, связанных с плотностью дендритных шипиков. Тем не менее, этот метод в значительной степени основан на трудоемком ручном подсчете, который может привести к систематической ошибке. Новые плагины, такие как SpineJ, позволяют проводить автоматическую количественную оценку, а также более точный анализ позвоночника и шеи¹⁹. Недостатком этих подходов является потеря трехмерного анализа для определения объема позвоночника, так как SpineJ ограничен двумерными стеками изображений. Кроме того, получение информации о подтипах позвоночника становится сложной задачей с помощью этих процессов. Четыре преобладающих подтипа шипов: тонкий, грибовидный, короткий и филоподийный, все они связаны с индивидуальными функциями и в значительной степени классифицируются по морфологии²⁰. Тонкие шипы характеризуются удлиненной шеей и четко выраженной головой²¹. Грибовидные колючки имеют гораздо более крупную и выраженную головку²². Короткие шипы короткие и имеют небольшую вариативность между головой и шеей²³. Филоподии – это неполовозрелые колючки с длинной, тонкой шеей и без явно заметной головы²⁴. В то время как классификация предоставляет ценную информацию, шипы существуют в континууме измерений. Классификация по категориям основана на диапазонах морфологических измерений^25,26. Ручное измерение корешков для классификации усложняет логистическую нагрузку для исследователей при таком подходе.

Другие варианты программного обеспечения, ориентированные конкретно на трехмерный дендритный анализ позвоночника, лучше подходят для исследований объема и свойств подтипов позвоночника 27,28,29,30,31. Несмотря на трудности, связанные с трехмерным анализом, такие как низкое разрешение в z-плоскости и размазывание, эти программные опции позволяют проводить надежную трехмерную реконструкцию дендритов и дендритных шипиков в полуавтоматическом режиме, управляемом пользователем. Автоматическая классификация идентифицированных позвоночников по их подтипам также присутствует в некоторых из этих программных пакетов для анализа позвоночника. Это может уменьшить опасения по поводу потенциальной рабочей нагрузки и экспериментальной систематической ошибки. Neurolucida 360 является одним из коммерчески доступных программ, позволяющих надежно и воспроизводимо идентификацию и классификацию трехмерных дендритных отростков³². Здесь мы представляем комплексный протокол для эффективной подготовки неподвижных тканей, получения изображений и, в конечном итоге, количественной оценки и классификации дендритных шипиков с помощью этого программного обеспечения.