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神経科学

자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용한 수지상 척추 정량화

Published: September 27, 2024
, , ,
1Section on Synapse Development Plasticity, National Institute of Mental Health,National Institutes of Health (NIH), 2Colgate University

概要

수지상 가시는 대부분의 흥분성 시냅스의 시냅스 후 구획입니다. 수지상 척추 형태의 변화는 신경 발달, 노화, 학습 및 많은 신경 및 정신 장애 중에 발생하며, 이는 신뢰할 수 있는 수지상 척추 분석의 중요성을 강조합니다. 이 프로토콜은 자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용하여 수상돌기 척추 형태를 정확하고 재현성 있게 정량화하는 방법을 설명합니다.

Abstract

시냅스 연결은 뉴런 간의 정보 교환 및 처리를 가능하게 합니다. 흥분성 시냅스의 시냅스 후 부위는 종종 수지상 가시에 형성됩니다. 수지상 가시는 시냅스 가소성, 신경 발달, 신경 및 정신 질환을 중심으로 한 연구에서 큰 관심을 받는 구조입니다. 수지상 가시는 수명 동안 구조적 변형을 겪으며, 총 척추 수, 수상돌기 척추 크기 및 형태학적으로 정의된 하위 유형과 같은 속성이 다양한 과정에 따라 변경됩니다. 수지상 가시의 이러한 구조적 변화를 조절하는 분자 메커니즘을 설명하는 것은 형태학적 측정에 의존합니다. 이를 위해서는 실험적 증거를 제공하기 위해 정확하고 재현 가능한 수지상 척추 분석이 필요합니다. 본 연구는 Neurolucida 360(자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어)을 사용하여 수지상 척추 정량화 및 분류를 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 총 척추 밀도, 척추 머리 부피 및 척추 아형으로의 분류와 같은 주요 수지상 척추 특성을 결정할 수 있으므로 수지상 척추 구조 표현형을 효과적으로 분석할 수 있습니다.

Introduction

수지상 가시는 종종 glutamatergic synapses 1,2의 시냅스 후 부위를 구성하는 수상돌기의 돌출부입니다. 수지상 가시는 시냅스 가소성 분야에서 특히 관심이 있습니다. 척추는 시냅스 강도가 변할 때 종종 변형되어 장기적인 시냅스 강화에서 커지고 강해지거나 장기적인 시냅스 함몰에서 더 작고 약해진다 3,4,5,6,7. 시냅스 가소성(synaptic plasticity)을 넘어서, 수상돌기 가시의 프로필은 일생에 걸쳐 변화합니다. 초기 발달에는 수지상 척추 형성 및 성장의 기간이 있으며, 그 후 정상 상태에 도달 할 때까지 수지상 척추 가지 치기가 뒤따릅니다 8,9,10. 노화된 뇌에서 척추 손실은 뇌 수축과 인지 기능 저하를 동반한다11. 또한 많은 신경학적, 신경퇴행성 및 정신 질환은 비정상적인 수지상 가시가 특징입니다. 정신분열증을 앓고 있는 개인의 여러 뇌 영역은 수상돌기 가시가 더 적은데, 이는 시냅스 가지치기의 변화로 인한 것으로 보인다12. 자폐 스펙트럼 장애는 수상돌기 척추 병리(dendritic spine pathology)에 의해서도 특징지어진다13. 수지상 척추 손실은 알츠하이머병과 파킨슨병의 특징입니다14,15. 수지상 척추 특성에 대한 연구를 포괄하는 광범위한 연구 주제를 감안할 때 정확한 척추 정량화를 위한 기술이 가장 중요합니다.

염색, 즉 골지법(Golgi method) 또는 염료 충전을 통한 뉴런 라벨링 또는 형광 단백질 발현은 수지상 척추 시각화를 위한 일반적인 방법이다 16,17,18. 시각화가 완료되면 다양한 무료 및 상용 소프트웨어 클라이언트를 사용하여 스파인을 분석할 수 있습니다. 원하는 분석 결과는 어떤 소프트웨어가 가장 많이 사용될지 결정하는 데 중요한 요소입니다. Fiji는 수지상 척추 밀도에 중점을 둔 질문에 대한 실행 가능한 소프트웨어 옵션입니다. 그러나 이 기술은 편향 가능성을 도입할 수 있는 시간 소모적인 수동 계산에 크게 의존합니다. SpineJ와 같은 새로운 플러그인은 자동 정량화를 허용하며 또한 보다 정확한 척추경부 분석을 허용합니다19. 이러한 접근 방식의 단점은 SpineJ가 2차원 이미지 스택으로 제한되기 때문에 척추 부피를 결정하기 위한 3차원 분석이 손실된다는 것입니다. 또한 이러한 프로세스를 통해 척추 하위 유형 정보를 얻는 것이 어려워집니다. 4가지 주요 척추 아형인 thin, mushroom, stubby, filopodia는 모두 개별 기능을 내포하며 크게 형태학(morphology)20을 통해 분류된다. 얇은 가시는 길쭉한 목과 뚜렷한 머리가 특징이다21. 버섯 가시는 훨씬 크고 뚜렷한 가시 머리를 가지고있다 22. 뭉툭한 가시는 짧고 머리와 목 사이에 거의 차이가 없다23. Filopodia는 길고 얇은 목과 명확하게 관찰 할 수있는 머리가 없는 미성숙한 가시입니다24. 분류는 가치 있는 정보를 제공하지만, 척추는 차원의 연속체에 존재합니다. 범주로의 분류는 형태학적 측정 범위(25,26)를 기반으로 한다. 분류를 위해 척추를 수동으로 측정하는 것은 이 접근 방식을 사용하는 연구원의 물류 부담을 가중시킵니다.

특히 3차원 수지상 척추 분석에 초점을 맞춘 다른 소프트웨어 옵션은 척추 부피 및 하위 유형 특성(27,28,29,30,31)에 대한 조사에 더 적합합니다. 낮은 z-plane 해상도 및 번짐과 같은 3차원 분석의 어려움에도 불구하고 이러한 소프트웨어 옵션을 사용하면 사용자 안내 반자동 방식으로 수상돌기 및 수상돌기 가시를 안정적으로 3차원으로 재구성할 수 있습니다. 식별된 척추를 하위 유형으로 자동 분류하는 것도 이러한 척추 분석 소프트웨어 패키지 중 일부에 있는 기능입니다. 이는 잠재적인 작업량과 실험적 편향에 대한 우려를 개선할 수 있습니다. Neurolucida 360은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 3차원 수지상 척추 식별 및 분류를 가능하게 하는 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 중 하나이다32. 여기에서는 이 소프트웨어를 사용하여 고정 조직을 효과적으로 준비하고, 이미지를 획득하고, 궁극적으로 수지상 가시를 정량화하고 분류할 수 있는 포괄적인 프로토콜을 제시합니다.

Protocol

모든 동물 시술은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 지침, 교내 연구에서 동물을 사용하는 지침을 따랐으며 미국 국립정신건강연구소(National Institute of Mental Health) 동물 관리 및 사용 위원회(National Institute of Mental Health Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 1. 고정 된 해마 절편의 준비 케타민/자일라진(케타민: 100mg/kg;…

Representative Results

이 분석 방법을 효과적으로 활용하는 것은 추적을 위한 수지상 세그먼트를 선택하는 것으로 시작됩니다. 그림 1에서 설명한 바와 같이, 추적을 위한 이상적인 수상돌기는 다른 수상돌기에 근접하지 않습니다. 병렬로 실행되는 수상돌기는 인접한 수상돌기에서 척추를 부적절하게 식별하는 결과를 초래할 수 있습니다. 다른 z 평면에서 직접 교차하거…

Discussion

이 프로토콜은 3차원 재구성 소프트웨어를 사용하여 시료 준비, 이미징, 수상돌기 척추 정량화 및 분류 과정의 특정 단계를 자세히 설명합니다. 이 소프트웨어는 다양한 조사에 기여하는 강력한 구조 데이터를 생성할 수 있는 강력한 도구입니다. 프로세스 전반에 걸쳐 이 프로토콜의 방법론적 부담을 줄이고 데이터의 전체 출력을 향상시키는 몇 가지 중요한 단계가 있습?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

기술 지원을 아끼지 않은 Carolyn Smith, Sarah Williams Avram, Ted Usdin 및 NIMH SNIR에 감사드립니다. 또한 Colgate University Bethesda Biomedical Research Study Group에도 감사드립니다. 이 작업은 NIMH 교내 프로그램(1ZIAMH002881 – Z.L.)의 지원을 받습니다.

Materials

518F Immersion Oil Zeiss 444960-0000-000
Cryostat Leica CM3050S For slice preparation
Fine Forceps FST 11150-10
Hemostat Forceps FST 13020-12
Large Surgical Scissors FST 14002-16
LSM 880 Confocal Microscope Zeiss LSM 880
Microscope Cover Glass Fisherbrand 12-541-035
Mini-Peristaltic Pump II Harvard Apparatus 70-2027 For perfusions
Neurolucida 360 MBF Bioscience v2022.1.1 Spine Analysis Software
Neurolucida Explorer MBF Bioscience v2022.1.1 Spine Analysis Software
OCT Compound Sakura Finetek 4583 For cryostat sectioning
Paraformaldehyde (37%) Fisherbrand F79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC Zeiss 440762-9904-000
Scalpel Blade FST 10022-00
Small Surgical Scissors FST 14060-09
Spatula  FST 10091-12
Sucrose FIsherbrand S5-500
Superfrost Plus Microslides Diagger ES4951+
Vectashield HardSet Mounting Medium Vector Laboratories H-1400-10
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参考文献

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Keary III, K. M., Sojka, E., Gonzalez, M., Li, Z. Dendritic Spine Quantification Using an Automatic Three-Dimensional Neuron Reconstruction Software. J. Vis. Exp. (211), e66493, doi: (2024).
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