Quantificazione della spina dendritica utilizzando un software di ricostruzione automatica dei neuroni tridimensionali

Le spine dendritiche sono sporgenze di dendriti che spesso comprendono il sito post-sinaptico delle sinapsi glutammatergiche ^1,2. Le spine dendritiche sono di particolare interesse nel campo della plasticità sinaptica. Le spine sono spesso alterate quando la forza sinaptica cambia, diventando più grandi e più forti nel potenziamento sinaptico a lungo termine o più piccole e più deboli nella depressione sinaptica a lungo termine 3,4,5,6,7. Oltre alla plasticità sinaptica, il profilo delle spine dendritiche cambia nel corso della vita. All’inizio dello sviluppo, c’è un periodo di formazione e crescita della spina dendritica, seguito da potatura della spina dendritica fino a raggiungere uno stato stazionario ^8,9,10. Nell’invecchiamento del cervello, la perdita della colonna vertebrale accompagna il restringimento cerebrale e il declino cognitivo¹¹. Inoltre, molti disturbi neurologici, neurodegenerativi e psichiatrici sono caratterizzati da spine dendritiche aberranti. Più regioni cerebrali in individui affetti da schizofrenia hanno meno spine dendritiche, probabilmente a causa di un’alterata potatura sinaptica¹². I disturbi dello spettro autistico sono caratterizzati anche da patologie della colonna vertebrale dendritica¹³. La perdita della spina dendritica è un segno distintivo sia del morbo di Alzheimer che del morbo di Parkinson^14,15. Data l’ampia gamma di argomenti di ricerca che comprendono le indagini sulle proprietà della colonna vertebrale dendritica, le tecniche per un’accurata quantificazione della colonna vertebrale sono di fondamentale importanza.

La colorazione, cioè il metodo Golgi, o la marcatura dei neuroni tramite riempimento di colorante o l’espressione di proteine fluorescenti sono metodi comuni per la visualizzazione della colonna vertebrale dendritica 16,17,18. Una volta visualizzate, le spine possono essere analizzate con una varietà di client software gratuiti e disponibili in commercio. L’output desiderato dell’analisi è un fattore importante per determinare quale software sarà più utile. Fiji è una valida opzione software per domande incentrate sulla densità della colonna vertebrale dendritica. Tuttavia, questa tecnica si basa in gran parte sul conteggio manuale che richiede molto tempo e che può introdurre il potenziale di distorsione. Nuovi plug-in come SpineJ consentono la quantificazione automatica, consentendo inoltre un’analisi più accurata del collo della colonna vertebrale¹⁹. Uno svantaggio di questi approcci è la perdita di un’analisi tridimensionale per determinare il volume della colonna vertebrale, poiché SpineJ è limitato a pile di immagini bidimensionali. Inoltre, ottenere informazioni sul sottotipo di colonna vertebrale diventa difficile attraverso questi processi. I quattro sottotipi predominanti di spina, sottile, a fungo, tozza e filopodia, connotano tutti funzioni individuali e sono in gran parte classificati attraverso la morfologia²⁰. Le spine sottili sono caratterizzate da un collo allungato e da una testa definita²¹. Le spine dei funghi hanno una testa della spina molto più grande e pronunciata²². Le spine tozze sono corte e hanno poca varianza tra la testa e il collo²³. I filopodi sono spine immature con un collo lungo e sottile e nessuna testa²⁴ chiaramente osservabile. Sebbene la classificazione fornisca informazioni preziose, le spine esistono su un continuum di dimensioni. La classificazione in categorie si basa su intervalli di misure morfologiche ^25,26. La misurazione manuale delle spine per la classificazione aggrava l’onere logistico per i ricercatori in questo approccio.

Altre opzioni software che si concentrano specificamente sull’analisi tridimensionale della colonna vertebrale dendritica sono più adatte per le indagini sul volume della colonna vertebrale e sulle proprietà del sottotipo 27,28,29,30,31. Nonostante le difficoltà presentate dall’analisi tridimensionale, come la scarsa risoluzione del piano z e lo striscio, queste opzioni software consentono una ricostruzione tridimensionale affidabile di dendriti e spine dendritiche in modo semi-automatizzato guidato dall’utente. La classificazione automatica delle spine identificate nei loro sottotipi è anche una caratteristica presente in alcuni di questi pacchetti software per l’analisi della colonna vertebrale. Ciò può migliorare le preoccupazioni relative al potenziale carico di lavoro e ai pregiudizi sperimentali. Neurolucida 360 è un software disponibile in commercio che consente l’identificazione e la classificazione tridimensionale della spina dendritica³² in modo affidabile e riproducibile. Qui, presentiamo un protocollo completo per preparare efficacemente il tessuto fissato, acquisire immagini e, infine, quantificare e classificare le spine dendritiche utilizzando questo software.