Un test de chimie acétyl-clic pour mesurer l’acétylation de l’histone acétyltransférase 1

Parmi les nombreuses acétyltransférases eucaryotes, HAT1 était l’histone acétyltransférase initiale à être isolée ^1,2,3. Des recherches ultérieures ont fermement établi son rôle central dans la réplication de la chromatine, en particulier dans la synthèse de nouveaux nucléosomes au cours de la phase^{S 4}. Nos efforts de recherche ont permis de reconnaître que HAT1 est fortement stimulé par le traitement par facteur de croissance épidermique (EGF) dans les cellules mammaires⁵. De plus, il est apparu que HAT1 est nécessaire à la prolifération cellulaire rapide et à la formation de tumeurs in vivo 6,7,8,9. Les données indiquent que HAT1 est essentiel à la coordination des processus anaboliques et épigénétiques pour la division cellulaire, conduisant la croissance tumorale.

HAT1 di-acétyle la queue amino-terminale de l’histone H4 sur les lysines 5 et 12 en complexe avec la protéine chaperon Rbap46, qui se lie à l’histone et présente l’amino-terminal à HAT1. Les tétramères d’histones ou disomes¹⁰, ainsi que HAT1/Rbap46 et d’autres chaperons d’histones¹¹, sont ensuite importés dans le noyau. Les histones sont ensuite libérées pour être déposées à la fourche de réplication ou à d’autres sites pour soutenir l’activation ou la répression des gènes. La fonction de la marque de di-acétylation HAT1 sur l’histone H4 n’est pas entièrement comprise. Il est probable qu’il est rapidement éliminé en l’espace de 15 à 30 minutes par l’action des histones désacétylases 12,13,14,15 après l’insertion de H4 dans la chromatine. Ainsi, la marque de di-acétylation HAT1 n’est pas propagée dans la chromatine et peut ne pas jouer un véritable rôle épigénétique, bien qu’un rôle dans le recrutement d’enzymes modifiant la chromatine dans la chromatine naissante ait été postulé¹². De plus, HAT1 n’acétyle pas directement la chromatine ; Son activité est limitée aux histones solubles.

Le développement de petites molécules inhibitrices de l’histone acétyltransférase a été entravé par des essais non spécifiques et à faible débit, ce qui a souvent entraîné la génération de composés biologiquement réactifs^16,17. Le test de référence pour mesurer les activités de l’acétyltransférase nécessite l’utilisation de ³H-acétyl-coA, ce qui limite le débit et nécessite des radiations. Néanmoins, récemment, des inhibiteurs spécifiques et très puissants de l’acétyltransférase à petites molécules ciblant CBP/p300¹⁸ et KAT6A/B^19,20 ont été décrits et confirmés par l’utilisation de ³H-acétyl-CoA. À l’avenir, des tests améliorés pour obtenir un meilleur débit et éviter les dangers en laboratoire sont en cours de conception.

Les progrès récents dans la surveillance de l’acétylation²¹ ont utilisé la chimie click pour permettre la surveillance des réactions enzymatiques. Il existe une variété de précurseurs à clic qui sont accessibles par de simples voies synthétiques ou disponibles à l’achat et qui peuvent être incorporés dans des réactions enzymatiques. Ces réactions sont généralement effectuées dans des systèmes recombinants, bien que des essais cellulaires soient également réalisables²². L’avantage des cofacteurs et des substrats à clic est que le criblage peut mesurer directement l’activité enzymatique sans avoir besoin de systèmes de lecture couplés qui sont souvent perturbés par les composés de criblage et nécessitent des étapes de manipulation supplémentaires. Cela permet des traitements inhibiteurs uniquement pendant l’étape enzymatique, alors que toutes les étapes de fonctionnalisation et de détection en aval sont effectuées après un lavage approfondi pour éliminer les composés, limitant ainsi le risque d’interférence avec le test. Ces avantages rendent la conception des tests par clic préférable aux tests couplés qui reposent généralement sur la détection de la coenzyme A libre.

Une considération importante est l’acceptation des cofacteurs cliquables dans le site actif de l’enzyme. Les cofacteurs à clic existants peuvent ne pas être entièrement compatibles avec le site actif optimisé pour le cofacteur natif. Les informations structurelles et la modélisation peuvent être utilisées pour concevoir des substitutions d’acides aminés afin d’élargir le site actif pour incorporer des substrats modifiés²³. Cela peut permettre un criblage avec une cinétique enzymatique améliorée et des niveaux de substrat et d’enzymes plus faibles. L’inconvénient de cette approche est que les poches catalytiques altérées peuvent ne pas identifier les inhibiteurs qui interagissent fortement avec l’enzyme native. En fin de compte, une combinaison d’approches est nécessaire pour identifier et valider les inhibiteurs enzymatiques potentiels.

Nous décrivons ici une méthode développée pour purifier et doser l’activité enzymatique HAT1 en utilisant le cofacteur clic 4-pentynoyl-CoA²⁴. Ce test (Figure 1) utilise la séquence enzymatique native en complexe avec sa protéine partenaire requise Rbap46, qui s’est avérée stimuler l’activité enzymatique. La purification de l’enzyme des cellules humaines permet l’activation enzymatique dans le cellulo, ce qui peut préserver des modifications post-traductionnelles stimulantes importantes pour une activité enzymatique complète. La conception et l’optimisation de tests d’enzymes recombinantes pour les criblages chimiques à haut débit ont été utilisées avec succès pour identifier et caractériser les inhibiteurs de petites molécules HAT1.