概要

Высокопроизводительный метод количественной оценки образования внеклеточных ловушек нейтрофилов в нейтрофилах человека в режиме реального времени

Published: December 01, 2023
doi:

概要

Мы представляем автоматизированный высокопроизводительный метод количественного определения внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ) с использованием системы анализа живых клеток в сочетании с подходом двойного красителя, зависящим от проницаемости мембраны.

Abstract

Нейтрофилы – это клетки миелоидной линии, которые составляют важнейшую часть врожденной иммунной системы. Последнее десятилетие выявило дополнительные ключевые роли, которые нейтрофилы играют в патогенезе рака, аутоиммунных заболеваний и различных острых и хронических воспалительных состояний, способствуя инициированию и сохранению иммунной дисрегуляции с помощью многочисленных механизмов, включая образование внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ), которые являются структурами, имеющими решающее значение для противомикробной защиты. Ограниченность методов количественной оценки образования НВЛ объективным, воспроизводимым и эффективным способом ограничила нашу способность к дальнейшему пониманию роли нейтрофилов в здоровье и болезнях. Мы описываем автоматизированный высокопроизводительный метод количественного определения нейтрофилов, претерпевающих образование НВЛ, в режиме реального времени, с использованием платформы визуализации живых клеток в сочетании с подходом двойного красителя, зависящим от проницаемости мембраны, с использованием двух разных красителей ДНК для визуализации внутриклеточной и внеклеточной ДНК. Эта методика может помочь оценить физиологию нейтрофилов и протестировать молекулы, которые могут быть нацелены на образование НВЛ.

Introduction

Внеклеточные ловушки нейтрофилов (НВЛ) представляют собой паутиноподобные структуры хроматина, выдавливаемые из нейтрофилов в ответ на различные воспалительные стимулы. НВЛ состоят из ДНК, гистонов и различных антимикробных белков/пептидов, которые улавливают и убивают инфекционные патогены и вызывают воспалительные реакции1.

В то время как НВЛ полезны для защиты организма от патогенов, они привлекли внимание как потенциальный фактор различных аутоиммунных заболеваний2, тромбоза3, метаболических заболеваний4 и метастатического роста рака5. Таким образом, ингибирование образования НВЛ является потенциальным терапевтическим вариантом для этих заболеваний. Однако, несмотря на то, что некоторые многообещающие молекулы, нацеленные на НВЛ, находятся в разработке6, до сих пор не существует одобренной терапии, которая бы конкретно влияла на этот механизм. Это, по крайней мере частично, объясняется отсутствием объективных, непредвзятых, воспроизводимых и высокопроизводительных методов количественной оценки для формирования НВЛ.

Мы разработали и описали новый метод с использованием двухцветной платформы визуализации живых клеток 7,8. Покадровые изображения нейтрофилов, окрашенных мембранопроницаемым ядерным красителем и мембранонепроницаемым красителем ДНК, анализируются программным обеспечением, и количество нейтрофилов до и после образования НВЛ подсчитывается в нескольких временных точках. Поскольку целостность плазматической мембраны теряется при образовании НВЛ в результате регуляции PKCα-опосредованного ламина B и CDK4/6-опосредованного ламина A/C9, нейтрофилы, образующие NET, окрашиваются мембранонепроницаемым красителем ДНК, в то время как здоровые нейтрофилы — нет. Этот метод преодолевает проблемы, связанные с ранее описанными методами количественной оценки образования НВЛ, и обеспечивает непредвзятое, высокопроизводительное, воспроизводимое и точное количественное определение НВЛ в автоматическом режиме.

Protocol

Нейтрофилы от здоровых людей были получены после того, как было предоставлено информированное согласие в соответствии с протоколом, утвержденным Национальным институтом здравоохранения (NIH) Институциональным наблюдательным советом (IRB). Протокол соответствует рекомендациям комитета…

Representative Results

Этот метод позволяет получать фазово-контрастные, красные флуоресцентные (мембранопроницаемый краситель) и зеленые флуоресцентные (мембранонепроницаемый краситель) изображения, полученные в каждый момент времени. Наряду с процессом формирования НВЛ, морфологические изменения наблю…

Discussion

Современные методы количественного определения НВЛ ex vivo имеют ряд недостатков, которые ограничивают нашу способность изучать нейтрофилы, НВЛ и потенциальные терапевтические мишени непредвзятым и высокопроизводительнымспособом. Например, прямой …

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Секцию световой визуализации Управления науки и технологий Национального института артрита и заболеваний опорно-двигательного аппарата и кожи Национальных институтов здравоохранения. Это исследование было поддержано Программой внутренних исследований Национального института артрита и заболеваний опорно-двигательного аппарата и кожи Национальных институтов здоровья (ZIA AR041199).

Materials

AKT inhibitor Calbiochem 124028
Clear 96-well plate Corning 3596
Live cell analysis system Sartorius N/A Incucyte Software (v2019B)
Membrane-impermeable DNA green dye  Thermo Fisher Scientific S7020
Nuclear red dye Enzo ENZ-52406 Neutrophil pellet becomes bluish after staining.
RPMI Thermo Fisher Scientific 11835030 Phenol red containig RPMI can be used.

参考文献

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
  3. Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
  4. Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
  5. De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595 (2021).
  6. Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
  7. Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
  8. Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
  9. Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
  10. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Induction and quantification of NETosis. Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).
  11. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837 (2021).
  12. Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12 (2019).
  13. von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
  14. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
  15. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).

Play Video

記事を引用
Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Real-Time High Throughput Technique to Quantify Neutrophil Extracellular Traps Formation in Human Neutrophils. J. Vis. Exp. (202), e66051, doi:10.3791/66051 (2023).

View Video