A encefalomielite autoimune experimental (EAE) serve como modelo animal de esclerose múltipla. Este artigo descreve uma abordagem para pontuar inflamação medular, desmielinização e lesão axonal em EAE. Adicionalmente, um método para quantificar os níveis de luz solúvel dos neurofilamentos no soro de camundongos é apresentado, facilitando a avaliação da lesão axonal em camundongos vivos.
A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo comum de esclerose múltipla (EM) de base imunológica. Esta doença pode ser induzida em roedores pela imunização ativa com componentes proteicos da bainha de mielina e adjuvante completo de Freund (CFA) ou pela transferência de células T efetoras específicas da mielina de roedores preparados com proteína mielina/CFA para roedores virgens. A gravidade do EAE é tipicamente pontuada em uma escala clínica de 5 pontos que mede o grau de paralisia ascendente, mas essa escala não é ideal para avaliar a extensão da recuperação do EAE. Por exemplo, os escores clínicos permanecem altos em alguns modelos de EAE (por exemplo, modelo de EAE induzido por peptídeo de glicoproteína de oligodendrócitos de mielina [MOG]), apesar da resolução da inflamação. Assim, é importante complementar o escore clínico com o escore histológico do EAE, que também fornece um meio para estudar os mecanismos subjacentes da lesão celular no sistema nervoso central (SNC).
Aqui, um protocolo simples é apresentado para preparar e manchar seções da medula espinhal e do cérebro de camundongos e para pontuar inflamação, desmielinização e lesão axonal na medula espinhal. O método para pontuar a infiltração leucocitária na medula espinhal também pode ser aplicado para pontuar a inflamação cerebral no EAE. Um protocolo para medir a luz solúvel de neurofilamentos (sNF-L) no soro de camundongos usando um ensaio Small Molecule Assay (SIMOA) também é descrito, o que fornece feedback sobre a extensão da lesão global do SNC em camundongos vivos.
A encefalomielite autoimune experimental (EAE) é o modelo murino mais comum para a doença desmielinizante humana, a Esclerose Múltipla (EM)1. A patologia inflamatória clássica da EM, incluindo a infiltração de células T helper produtoras de IFN-γ (gama) e IL-172, a infiltração de monócitos inflamatórios3, a formação de lesões desmielinizantes inflamatórias perivasculares e submeníngeas4 e a ocorrência de lesão axonal4 no sistema nervoso central (SNC), também é observada nas EAE 5,6,7,8,9. A semelhança nos mecanismos imunológicos entre EAE e MS tornou o EAE um modelo pré-clínico adequado para testar a eficácia e os mecanismos de ação de várias terapias imunológicas aprovadas para a EM, incluindo natalizumabe, fingolimode, fumarato de dimetilo e acetato de glatiramer (revisado em 1,5). Alguns regimes EAE modelam outros aspectos da patologia progressiva da EM além da lesão axonal, incluindo o desenvolvimento de inflamação submeníngea no cérebro, desmielinização crônica, atrofia medular, sinapse e perda de neurônios 6,10,11,12. Assim, a EAE tem utilidade para rastrear a eficácia de terapias neuroprotetoras para a SM.
EAE é induzido em roedores de várias maneiras. A imunização ativa é o método de indução mais comum e envolve a imunização de roedores com antígenos da mielina (proteínas integrais ou peptídeos) emulsionados em CFA suplementado com Mycobacterium tuberculosis morto pelo calor 13. Dependendo da cepa do camundongo, a toxina pertussis (PTX) também é administrada no dia 0 e no dia 2 da imunização para aumentar a penetrância da doença13. O EAE também pode ser induzido pela transferência adotiva de células T mielina-específicas obtidas de camundongos preparados com mielina/CFA para camundongos saudáveis14 ou pode se desenvolver espontaneamente em camundongos que superexpressam receptores de células T específicos para os principais antígenos da mielina5.
A gravidade e a progressão da doença EAE são comumente pontuadas usando uma escala clínica discreta de 5 pontos: 1 – claudicação da cauda, 2 – fraqueza dos membros posteriores ou pés, 3 – paralisia completa em um ou ambos os membros posteriores, 4 – fraqueza dos membros torácicos, 5 – moribundos ou mortos13. Esse sistema de escore clínico é sólido em documentar a progressão da paralisia ascendente que ocorre no início da doença, mas é menos sensível em capturar a extensão da recuperação de ataques inflamatórios do SNC. Por exemplo, tanto os ratos que deambulam com dificuldade como os ratos que deambulam facilmente, mas apresentam fraqueza de preensão dos pés, recebem uma pontuação de 2 na escala EAE. Os escores podem permanecer elevados na fase pós-aguda do EAE devido à presença de lesão ou perda permanente do axônio, mesmo apesar da resolução da respostainflamatória9. Houve uma variedade de tentativas de desenvolver sistemas de pontuação mais refinados, testes comportamentais, medidas de força de membros pélvicos e de preensão manual e sistemas de monitoramento infravermelho para melhor captar diferenças nos déficits clínicos em EAE9,16,17,18; no entanto, essas medidas de pontuação mais intrincadas não distinguem a contribuição da inflamação versus lesão tecidual para os déficits neurológicos subjacentes. Assim, a abordagem padrão-ouro para pontuar a gravidade do EAE é realizar pontuação clínica e histológica.
Aqui, é descrito um protocolo de como dissecar e incorporar espécimes da medula espinhal e do cérebro de camundongos em parafina de forma a capturar o processo estocástico de formação de lesões que ocorre no EAE. Também é apresentado um protocolo de como corar cortes com Luxol fast blue (LFB), originalmente criado por Kluver e Barrera19, que detecta mielina no SNC. Os cortes são corados apenas com LFB (para análise de desmielinização) ou são contracorados com hematoxilina e eosina (H&E) para ajudar a visualizar e pontuar lesões inflamatórias. Protocolos também são fornecidos para quantificar a presença de leucócitos totais (CD45), a perda de mielina e o número de axônios lesados (SMI-32) na medula espinhal usando anticorpos disponíveis comercialmente, técnicas de imuno-histoquímica (IHQ) e software de acesso público. O protocolo usado para quantificar leucócitos na medula espinhal também pode ser aplicado para quantificar leucócitos no cérebro.
A avaliação histológica da perda e lesão axonal no cérebro é comparativamente mais difícil do que na medula espinhal, uma vez que os tratos da substância branca cerebral não correm em paralelo uns aos outros. A medida da luz sérica de neurofilamentos (sNF-L) tem emergido como um promissor biomarcador de lesão neuronal naEM20,21. Estudos recentes têm estendido essa tecnologia para EAE 22,23,24. Aqui, um método é apresentado para medir a luz de neurofilamento sérico (sNF-L) em camundongos vivos usando um ensaio Small Molecule Assay (SIMOA). Este método requer apenas uma pequena quantidade de soro e pode ser feito em camundongos vivos em apenas meio dia, fornecendo feedback rápido sobre como uma terapia testada está afetando a lesão geral do SNC. Todos os métodos descritos aqui podem ser aplicados a camundongos de qualquer sexo ou linhagem.
A coloração histológica da medula espinhal é uma ferramenta importante na avaliação da gravidade da doença EAE, particularmente nos casos em que há diferenças entre os grupos de tratamento na extensão da recuperação da doença na fase pós-aguda da doença. A coloração para infiltração de células imunes (CD45), mielina (LFB) e lesão axonal (SMI-32) ajuda a caracterizar a causa subjacente dos escores clínicos alterados em camundongos. O protocolo de coloração histológica aqui descrito fornece uma perspectiva da inflamação, bem como da extensão da mielina e da lesão axonal. Além disso, os resultados mostraram validar a medida do NFL-L como um método para avaliar a extensão do dano neuronal global em EAE.
Os parâmetros críticos para esta análise são garantir que os investigadores sejam cegados para a identidade das seções e que haja amostragem equivalente em cada nível da medula espinhal nos diferentes camundongos. Isso ocorre porque a gravidade da inflamação pode ser maior em níveis mais baixos do cordão. Outro parâmetro crítico é o tamanho dos grupos experimentais. A medula espinhal e os cérebros são tipicamente colhidos de 6 a 8 camundongos por grupo no final para ver diferenças significativas entre grupos com tratamentos ou genótipos com tamanhos de efeito modestos. Também é importante garantir que os camundongos selecionados, quando calculados em média, tenham escores médios representativos de todo o grupo. Em relação à solução de problemas, um problema comum encontrado por aqueles que não têm experiência com o protocolo é que a medula espinhal é fixada por um período insuficiente de tempo e não é facilmente extrudada da coluna vertebral. Se este for o caso, a medula espinhal pode ser dissecada manualmente da coluna por clipe ao longo dos processos espinhosos usando tesouras finas e abrindo a coluna para revelar a medula espinhal. Alternativamente, os tecidos podem ser fixados por alguns dias adicionais sem interferir no sucesso da coloração de anticorpos. Os clones de anticorpos aqui descritos funcionam em tecidos fixados até 2 semanas em formalina.
Incorporar as peças da medula espinhal requer habilidade e prática. Recomenda-se o uso de lupas oculares e a direção de uma lâmpada sobre a estação de incorporação para melhor visualizar se as seções estão caindo em seção transversal ou longitudinal. Manter os comprimentos dos pedaços da medula espinhal em menos de 2 mm durante a captação irá ajudá-los a cair na secção transversal. Outro problema comum encontrado para usuários menos experientes é que o LFB evapora durante a incubação durante a noite, deixando metade da lâmina manchada e metade sem manchas. Para evitar a evaporação, a placa de coloração de vidro deve ser selada com filme termoplástico e, em seguida, filme plástico. Se ocorrer evaporação e as seções forem coradas de forma desigual, recomenda-se desazular completamente as lâminas com carbonato de lítio e recolori-las novamente em LFB durante a noite. Outro problema comum é que os usuários não desazuisam totalmente a massa cinzenta após o LFB. É fundamental examinar seções individuais sob o microscópio para garantir que uma quantidade suficiente de desrubor tenha sido alcançada antes de prosseguir com outras etapas do protocolo. Além disso, embora as colorações de IHQ CD45 e SMI-32 tenham um desempenho robusto, ainda é importante identificar as concentrações de anticorpos em experimentos preliminares para cada novo lote de anticorpos recebido. Isso pode ser feito testando uma variedade de concentrações do anticorpo em uma seção de controle positivo (EAE medula espinhal). A primeira coloração também deve incluir um controle negativo que consiste em anticorpo secundário isolado sem adição de anticorpo primário. Finalmente, é fundamental na análise de imagens limitar imagens individuais, pois a coloração pode ser desigual entre slides ou seções.
Este protocolo utiliza software disponível gratuitamente. Se a pessoa não tiver acesso a um processador, um incorporador ou micrótomo, essas etapas podem ser fornecidas a um núcleo de patologia hospitalar que ofereça esses serviços. Além disso, se não tiver acesso a um scanner de lâminas, pode-se usar um microscópio de luz equipado com uma câmera de vídeo para salvar imagens TIFF da medula espinhal ou regiões cerebrais. Para um fluxo de trabalho baseado em microscópio, capture cortes LFB ou LFB/H&E em baixa potência (aumento de 40x) e para coloração de CD45 e SMI-32, imagine pelo menos quatro janelas centradas nas partes ventral, dorsal e lateral da medula espinhal (aumento de 200x para CD45 e aumento de 400x para SMI-32). A análise das imagens pode ser realizada para quantificar a coloração de maneira semelhante à descrita.
A decisão de qual abordagem histológica tomar para pontuar EAE depende do quanto os escores clínicos diferem entre os grupos. Por exemplo, se houver diferenças drásticas no escore clínico do EAE (um grupo recebeu EAE e outro não), isso geralmente está relacionado a diferenças na inflamação mediada por periféricos. Neste caso, pontuar a presença de lesões desmielinizantes nos cortes corados com BFL/H&E é suficiente e revelará diferenças entre os grupos. Se os grupos forem mais semelhantes no escore clínico no início e, em vez disso, houver diferenças na extensão da recuperação clínica (por exemplo, experimento na Figura 5A), é melhor aplicar o fluxo de trabalho histológico completo descrito aqui, incluindo a pontuação da inflamação cerebral no tronco cerebral e no cerebelo, para distinguir se as diferenças na cronicidade da doença estão relacionadas a diferenças na inflamação ou dano tecidual. Se forem encontradas diferenças na inflamação, conforme avaliado pela contagem de CD45, estudos adicionais de IHQ podem ser feitos para corar células T (anti-CD3), monócitos/macrófagos infiltrantes (Mac3) e micróglia (Iba-1/TMEM119) (clones de anticorpos recomendados estão na Tabela Suplementar 3). A ativação da micróglia é refletida por um aumento na intensidade da coloração de Iba-1 na micróglia de dupla marcação Iba-1+TMEM-19+ e um aumento da retração dos processos da micróglia que pode ser avaliado pela análise Sholl nas seções32. Além disso, técnicas como citometria de fluxo ou sequenciamento de RNA de célula única podem ser aplicadas para conduzir uma caracterização mais profunda da frequência e fenótipo de populações imunes no cérebro e na medula espinhal.
A contagem de axônios SMI-32+ é um método sensível para detectar lesão axonal em EAE32,33 e em MS34. SMI-32, que detecta a forma não fosforilada de neurofilamento pesado ou médio acumula-se em bulbos terminais de neurônios transeccionados. Uma alternativa para detectar axônios lesados é a coloração com proteína precursora de amiloide (APP) que pode se acumular nos axônios como resultado da interrupção do transporte de axônios33. O padrão de coloração para SMI-32 e PFA, embora ambos reflitam lesão axonal, normalmente não se sobrepõem, indicando que estão detectando patologias diferentes33. Pode-se também complementar as medidas histológicas da lesão axonal medindo o NF-L, que é uma medida rápida e sensível da lesão axonal em curso tanto na medula espinhal quanto no cérebro. Ele oferece a vantagem de que pode ser feito em meio dia em ratos vivos. Uma desvantagem deste método é que os kits são caros e a máquina é altamente especializada. A empresa que vende o kit sNF-L oferece uma taxa de serviço para quem não tem acesso a uma máquina SIMOA. Uma alternativa para avaliar a lesão axonal é pontuar a perda axonal contando axônios em cortes corados com azul de toluidina da medula espinhal12 ou contando feixes de neurofilamentos detectados por SMI-31 em áreas da substância branca da medula espinhal32. Ambas as abordagens são mais trabalhosas do que a medida de SMI-32 ou sNF-L.
Se os escores clínicos do EAE diferirem entre os grupos, mas a pontuação para inflamação, desmielinização e lesão axonal não revelar diferenças entre os grupos, pode ser útil corar para ativação de astrócitos usando GFAP (ver Tabela Suplementar 3 para clone de anticorpos recomendado). A ativação astrocitária está associada a um aumento na coloração de GFAP e isso se correlacionou com a progressão do EAE em alguns modelos de EAE, incluindo EAE crônico no rato DA35.
Em conclusão, este protocolo descreve métodos e fornece um fluxo de trabalho de análise para conduzir a pontuação histológica do EAE.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Dr. Raymond Sobel (Universidade de Stanford) por nos mostrar seu método de grossar e corrigir seções do cérebro e da medula espinhal. Agradecemos a Kyle Roberton e Milan Ganguly, do Toronto Centre for Phenogenomics, por aprenderem o método de incorporação e por cortarem tantas de nossas seções do cérebro e da medula espinhal. Agradecemos ao Dr. Matthew Cussick e ao Dr. Robert Fujinami (Universidade de Utah) por compartilharem seus protocolos para pontuar inflamação submeníngea e perivascular na medula espinhal. Agradecemos a Shalina Ousman por compartilhar o clone do anticorpo CD45. Agradecemos a Xiofang Lu pelo treinamento no processador de tecidos e na estação de incorporação de tecidos e pela manutenção deste equipamento no Keenan Research Centre of Biomedical Research no St. Michael’s Hospital. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa Biomédica da MS Canada (para SED). Carmen Ucciferri é apoiada por um estudante do Governo do Canadá. Nuria Alvarez-Sanchez é apoiada por uma bolsa de pós-doutorado Keenan.
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Used to fix spinal cord and brain specimens |
1000 mL Glass Beaker | Pyrex | 1000 | |
15 mL Falcon Tube | Starstedt | 62.554.100 | Fixing and storing spinal cord and brain |
250 mL Erlenmeyer Flask | Pyrex | 4980 | |
500 mL Glass Beaker | Pyrex | 1003 | |
92 mm x 16 mm Petri Dishes | Starstedt | 82-1473-001 | Used in the tissue grossing procedure |
95% Ethyl Alcohol | Commercial Alcohols | P016EA95 | Dehydration and rehydration steps |
ABC Elite Kit | Vector Labratories | PK6100 | Used for immunohistochemistry labeling |
Aqua Hold 2 PAP Pen | Cole Parmer | UZ-75955-53 | Used for drawing around tissue sections in Immunohistochemical Staining |
Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector Labratories | SP-2001 | |
Biosafety Cabinet | Any | ||
Biotinylated rabbit anti-rat IgG | Vector Labratories | BA-4000 | Used for CD45 staining |
C57BL6/J Mice | Jackson Laboratory | Stock # 664 | These mice were used in experiments shown in paper. |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST Plus | |
CitriSolv | Fisher Scientific | 04-355-121 | Used for de-waxing. Is an alternative to xylene |
DAB Kit | Vector Labratories | SK-4100 | Used for developing in immunohistochemistry |
ddH2O | – | – | |
Disposable Scalpel | Magna | M92-10 | Used for grossing spinal cord and brain |
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining dish | Cole Parmer | UZ-48585-60 | Used for histochemical staining and washes |
DWK Life Sciences (Wheaton) glass staining rack | Cole Parmer | 10061392 | Used for immunohistochemistry and histochemistry |
Eosin Y | Bioshop | 173772-87-1 | Stains cytoplasm |
Feather Microtome Blades | Fisher Scientific | 12-634-1C | Used for sectioning paraffin |
Filter Paper | Whatman | 1001110 | Used to filter the formalin (during grossing) and the luxol fast blue |
Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14160-10 | Used to snip brain and the skull |
Fumehood | Any | ||
Gibco DPBS | Fisher Scientific | 14190944 | |
Glacial Acetic Acid | BioShop | ACE333.4 | Used in the luxol fast blue staining procedure |
Histoplex Histology Containers | Starplex Scientific | 565-060-26 | Fixing spinal cord and brain |
Hydrogen Peroxide | Fisher Chemicals | H325-500 | Used to remove endogenous peroxidase in the tissue |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
Kimtech Science Kimwipes | Kimberly Clark Professional | 34155 | Used for immunohistochemistry |
Lens paper | VWR | 52846-001 | Used for trapping spinal cord species in cassette during processing |
Light microscope | Any | ||
Lithium carbonate | Sigma Aldrich | 554-13-3 | De-blueing after luxol fast blue staining |
Luxol blue | Sigma Aldrich | 1328-51-4 | Stains CNS myelin |
M.O.M Immunodetection Kit | Vector Labratories | BMK-2202 | Used to stain SMI-32 |
Methanol | Fisher Chemicals | A454.2 | Used for fixation |
Mayer's Hematoxylin | Electron Microscopy Sciences | 26381-02 | Stains nuclei |
Micro-Adson Forceps with Teeth | Fine Science Tools | 11027-12 | Used for reflecting the skull during dissections |
Microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
Microvette Capillary Tubes CB 300 Z | Starstedt | 16.440.100 | Used for blood collection |
Micrscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12545A | Used for coverslipping |
Mini Shaker | VWR | 12620-938 | Used for making buffers |
NF light kit | Quanterix | 103186 | This kit can be used for detection of mouse or human soluble neurofilament in serum |
Nitrile Gloves | VWR | 76307-462 | Safety |
Normal Goat Serum | Vector Labratories | S-1000 | Blocking reagent |
Normal Rabbit Serum | Vector Labratories | S-5000 | Blocking reagent |
OmniSette Tissue Cassettes | Fisher Scientific | M4935FS | Used for embedding spinal cord and brain |
p1000 Pipette and Tips | various | ||
p200 Pipette and Tips | various | ||
Paraffin Embedding station | Leica Biosystems | Model EG1160 | |
Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Medium | Leica Biosystems | 39601006 | Used for embedding spinal cord and brain |
Permount Mounting Medium | Fisher Chemicals | SP15-100 | Used for mounting coverslips on slides |
pH meter | Fisher Scientific | 13636AB315B | Used for pHing buffers |
Plastic Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-20 | Used for pHing buffers |
Potassium Chloride | BioShop | 7447-40-7 | Used for making PBS |
Potassium Phosphate Monobasic | BioShop | 7778-77-0 | Used for making PBS |
Pressure Cooker | Nordic Ware | Tender Cooker | |
Purified rat anti-mouse CD45 | Vector Labratories | 553076 | Detects leukocytes |
Reagent grade alcohol 100% | VWR | 89370-084 | Dehydration and rehydration steps |
Reagent grade alcohol 70% | VWR | 64-17-5 | Dehydration and rehydration steps |
Rotary Microtome | Leica Biosystems | Model RM2235 | |
Simoa Machine | Quanterix | HD-X | |
Slide Scanner | Zeiss | AxioScan.Z1 | |
SMI-32 mouse IgG1 antibody | Biolegend | 801701 | Detects damaged axons |
Sodium Chloride | BioShop | 7647-14-5 | Used for making PBS |
Sodium Phosphate Dibasic | Bioshop | 7558-79-4 | Used for making PBS |
Standard Adson Forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | Used for dissection steps |
Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Used to collect sections |
Surgical Tough Cuts | Fine Science Tools | 14110-15 | Used to cut through the spine, body wall, and skin |
Tissue Processor | Leica Biosystems | Model TP1020 | |
Tri-soldium citrate | Thermo Fisher Scientific | 03-04-6132 | Used for antigen retrieval |
Tween-20 | BioBasic | 9005-64-5 | Used for washing sections |
X-P Pierce XP-100 plate seal | Excel Scientific | 12-140 | Used for the sNF-L Assay |
Xylene | Fisher Chemicals | 1330-20-7 | Used for de-waxing and clearing sections |
Funnel | Cole Parmer | RK-63100-64 | Used to filter formalin before grossing tissue |
Stir Plate | Any | Used to make solutions | |
Oven | Any | Used to bake tissue sections after cutting | |
Parafilm | Bemis | 13-374-10 | Used to seal LFB staining dish |
Microwave | Any | Timing may vary depending on the microwave model | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Used to make blocking buffer |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408–129 | Used to store mouse serum samples |
Vortex | Any | Used to prepare samples for sNF-L assay | |
Waterbath | Any | Used to warm enzyme substrate for sNF-L assay |