اضطراب جيني عالي الكفاءة في البلاعم الأولية المشتقة من نخاع العظم باستخدام مجمعات Cas9-sgRNA الكهربائية
概要
يصف هذا البروتوكول إجراء تحرير الجينوم في البلاعم المشتقة من نخاع عظم الفأر باستخدام مجمعات البروتين النووي الريبي Cas9-sgRNA المجمعة في المختبر وتسليمها عن طريق التثقيب الكهربائي.
Abstract
تعد البلاعم المشتقة من نخاع العظم (BMDMs) من الفئران أداة رئيسية لدراسة البيولوجيا المعقدة لبلاعم الأنسجة. كخلايا أولية ، فإنها تمثل فسيولوجيا البلاعم في الجسم الحي بشكل أوثق من خطوط خلايا البلاعم الخالدة ويمكن اشتقاقها من الفئران التي تحمل بالفعل تغييرات جينية محددة. ومع ذلك ، فإن تعطيل وظيفة الجينات في BMDMs لا يزال يمثل تحديا تقنيا. هنا ، نقدم بروتوكولا لتحرير جينوم CRISPR / Cas9 الفعال في BMDMs ، والذي يسمح بإدخال عمليات إدخال وحذف صغيرة (indels) تؤدي إلى طفرات إزاحة الإطار التي تعطل وظيفة الجينات. يصف البروتوكول كيفية تجميع الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه (sgRNA-Cas9) وتشكيل مجمعات البروتين النووي الريبي sgRNA-Cas9 المنقاة (RNPs) التي يمكن توصيلها عن طريق التثقيب الكهربائي. كما يوفر طريقة فعالة لمراقبة كفاءة التحرير باستخدام تسلسل سانجر الروتيني وبرنامج تحليل متاح مجانا عبر الإنترنت. يمكن تنفيذ البروتوكول في غضون 1 أسبوع ولا يتطلب بناء البلازميد. ينتج عنه عادة كفاءة تحرير تتراوح من 85٪ إلى 95٪.
Introduction
البلاعم هي خلايا مناعية فطرية تلعب أدوارا حاسمة في إصلاح الأنسجة والمناعة 1,2. تتميز خطوط خلايا البلاعم الخالدة ، مثل خلايا الماوس RAW 264.7 أو خلايا THP-1 البشرية ، بالعديد من الخصائص المفيدة ، بما في ذلك النمو القوي وسهولة تعطيل الجينات عن طريق توصيل ناقلات لتداخل الحمض النووي الريبي أو CRISPR / Cas9 3,4. ومع ذلك ، فإن التحول السرطاني يغير بشكل كبير فسيولوجيتها ، مما يؤدي إلى التنشيط الشاذ لبعض المسارات والاستجابات الصامتة للآخرين 5,6. تلخص البلاعم الأولية المشتقة من نخاع العظم (BMDMs) بشكل أوثق في فسيولوجيا البلاعم في الجسم الحي ، ولكنها تظل صعبة التلاعب وراثيا بسبب الكفاءة المنخفضة لكل من نقل البلازميد والنقل الفيروسي في هذه الخلايا المناعية الأولية 7,8. وبالتالي ، هناك حاجة إلى طرق أكثر كفاءة لتعطيل وظيفة الجينات.
يعد تحرير الجينوم CRISPR / Cas9 أداة قوية للتلاعب الجيني عبر مجموعة من الأنظمة البيولوجية ، بما في ذلك خلايا الثدييات9،10،11،12. يقوم بروتين Streptococcus pyogenes Cas9 بكفاءة وعلى وجه التحديد بشق الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت به السبل عند تعقيده باستخدام الحمض النووي الريبي الإرشادي الخاص بالتسلسل. يؤدي إصلاح الحمض النووي من خلال الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) للحمض النووي المشقوق إلى عمليات إدخال أو حذف صغيرة (indels) تخلق طفرات إزاحة الإطار. في الدراسات المبكرة ، تم تسليم Cas9 و sgRNAs من خلال ناقلات البلازميد أو الفيروسات العدسية ، وهي طرق توصيل فعالة للعديد من خطوط الخلايا 9,10. ومع ذلك ، فإن الخلايا الأولية ، وعلى وجه الخصوص ، الخلايا المناعية الأولية غالبا ما تكون مقاومة لهذه الطرق بسبب انخفاض كفاءة توصيل النواقل عن طريق النقل أو التنبيث. بعد ذلك ، تم تطوير طرق لتوليد مجمعات sgRNA-Cas9 في المختبر وتسليمها عن طريق التثقيب الكهربائي ، وقد حققت هذه الطرق كفاءة عالية في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا13,14. اقترحت النتائج إمكانية استخدام هذا النهج لإجراء تحرير الجينوم في البلاعم الأولية.
هنا ، نقدم بروتوكولا لاستخدام مجمعات البروتين النووي الريبي sgRNA-Cas9 (RNPs) لإجراء تحرير الجينوم في BMDMs الأولية. يحتوي على خطوات للتخفيف من تنشيط أجهزة الاستشعار المناعية الموجودة في الخلايا المناعية الأولية ويؤدي إلى تحرير يصل إلى 95٪ في المواقع المستهدفة بأقل قدر من السمية. يتضمن هذا البروتوكول أيضا مهام سير العمل لتقييم كفاءة التحرير باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الروتيني (PCR) وتسلسل سانجر ، يليه في تحليل السيليكو بواسطة تتبع Indels بواسطة التحلل (TIDE) 15 ، وهي أداة برمجية عبر الإنترنت تم التحقق من صحتها جيدا.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح تحرير الجينوم باستخدام مجمعات Cas9-sgRNA المكهربة بالتعطيل الفعال لوظيفة الجينات في BMDMs. تختلف كفاءة التحرير حسب التسلسل المستهدف والجين. عادة ، يتم فحص أربعة إلى خمسة sgRNAs بشكل عام لتحديد واحد نشط للغاية. تتمتع بعض المواضع بكفاءة تحرير أقل ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى بنية الكروماتين. في هذه…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة 5R01AI144149. تم إنشاء الأشكال التخطيطية باستخدام BioRender.
Materials
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
参考文献
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis, and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).
- Laugel, B., et al. Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells. The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).
- Andreu, N., et al. Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis. Scientific Reports. 7, 42225 (2017).
- Roberts, A. W., et al. Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond. eLife. 8, e45957 (2019).
- Oberdoerffer, P., et al. Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages. Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).
- Ma, S., et al. YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells. Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
- Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. University of California, Davis. , (2022).
- Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA. Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).
- Yu, X., et al. Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX. Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).
