שיבוש גנים ביעילות גבוהה במקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם באמצעות קומפלקסים מחושמלים של Cas9-sgRNA
概要
פרוטוקול זה מתאר את הליך עריכת הגנום במקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר באמצעות קומפלקסים של Cas9-sgRNA ribonucleoprotein המורכבים במבחנה ומועברים על ידי אלקטרופורציה.
Abstract
מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM) מעכברים הם כלי מפתח לחקר הביולוגיה המורכבת של מקרופאגים ברקמות. כתאים ראשוניים, הם מדגימים את הפיזיולוגיה של מקרופאגים in vivo באופן הדוק יותר מאשר שורות תאי מקרופאגים אימורטליים, וניתן לגזור אותם מעכברים שכבר נושאים שינויים גנטיים מוגדרים. עם זאת, שיבוש תפקוד הגנים ב- BMDM נותר מאתגר מבחינה טכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לעריכת גנום CRISPR/Cas9 יעילה ב- BMDM, המאפשר החדרה של החדרות ומחיקות קטנות (indels) הגורמות למוטציות frameshift המשבשות את תפקוד הגנים. הפרוטוקול מתאר כיצד לסנתז RNA מדריך יחיד (sgRNA-Cas9) וליצור קומפלקסים מטוהרים של ריבונוקלאו פרוטאין sgRNA-Cas9 (RNPs) שניתן להעביר באמצעות אלקטרופורציה. הוא גם מספק שיטה יעילה לניטור יעילות העריכה באמצעות ריצוף Sanger שגרתי ותוכנית ניתוח מקוונת זמינה באופן חופשי. הפרוטוקול יכול להתבצע בתוך שבוע ואינו דורש בניית פלסמיד; התוצאה היא בדרך כלל יעילות עריכה של 85% עד 95%.
Introduction
מקרופאגים הם תאי חיסון מולדים הממלאים תפקידים קריטיים בתיקון רקמות ובמערכת החיסון 1,2. לקווי תאי מקרופאגים אימורטליים, כגון תאי עכבר RAW 264.7 או תאי THP-1 אנושיים, יש מספר מאפיינים מועילים, כולל צמיחה חזקה וקלות של שיבוש גנים על ידי העברת וקטורים להפרעות RNA או CRISPR/Cas9 3,4. עם זאת, טרנספורמציה אונקוגנית משנה באופן דרמטי את הפיזיולוגיה שלהם, מה שמביא להפעלה חריגה של מסלולים מסוימים ותגובות מושתקות של אחרים 5,6. מקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם (BMDMs) דומים יותר לפיזיולוגיה של מקרופאגים in vivo, אך עדיין מאתגרים למניפולציה גנטית בשל היעילות הנמוכה הן של טרנספקציית פלסמיד והן של התמרה נגיפית בתאי חיסון ראשוניים אלה 7,8. לפיכך, יש צורך בשיטות יעילות יותר לשיבוש תפקוד הגנים.
עריכת גנום CRISPR/Cas9 היא כלי רב עוצמה למניפולציה גנטית במגוון מערכות ביולוגיות, כולל תאי יונקים 9,10,11,12. חלבון Streptococcus pyogenes Cas9 קוטע ביעילות ובאופן ספציפי DNA דו-גדילי כאשר הוא מורכב עם RNA מנחה ספציפי לרצף. תיקון DNA באמצעות חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) של הדנ”א השסוע גורם להחדרות או מחיקות קטנות (indels) היוצרות מוטציות frameshift. במחקרים מוקדמים, Cas9 ו-sgRNA הועברו באמצעות וקטורים פלסמידים או לנטי-ויראליים, שהם שיטות העברה יעילות עבור קווי תאים רבים 9,10. עם זאת, תאים ראשוניים, ובמיוחד תאים חיסוניים ראשוניים, הם לעתים קרובות עקשנים לשיטות אלה בשל היעילות הנמוכה של העברת וקטורים על ידי טרנספקציה או טרנסדוקציה. לאחר מכן, פותחו שיטות ליצירת קומפלקסים sgRNA-Cas9 במבחנה ולהעברתם באמצעות אלקטרופורציה, ושיטות אלה השיגו יעילות גבוהה במגוון סוגי תאים13,14. התוצאות הצביעו על האפשרות להשתמש בגישה זו לביצוע עריכת גנום במקרופאגים ראשוניים.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול לשימוש בקומפלקסים של ריבונוקלאו פרוטאין sgRNA-Cas9 (RNPs) לביצוע עריכת גנום ב- BMDM ראשוניים. הוא מכיל צעדים להפחתת ההפעלה של חיישני החיסון הנמצאים בתאי חיסון ראשוניים ומביא לעריכה של עד 95% באתרים ממוקדים עם רעילות מינימלית. פרוטוקול זה כולל גם זרימות עבודה להערכת יעילות העריכה באמצעות תגובת שרשרת שגרתית של פולימראז (PCR) וריצוף Sanger, ולאחר מכן ניתוח סיליקו על ידי Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, כלי תוכנה מקוון מאומת היטב.
Protocol
Representative Results
Discussion
עריכת גנום באמצעות קומפלקסים חשמליים של Cas9-sgRNA מאפשרת שיבוש יעיל של תפקוד הגנים ב-BMDM. יעילות העריכה משתנה בהתאם לרצף היעד ולגן היעד. בדרך כלל, ארבעה עד חמישה sgRNA נבדקים בדרך כלל כדי לזהות אחד פעיל מאוד. לאתרים מסוימים יעילות עריכה נמוכה יותר, ככל הנראה בשל מבנה הכרומטין. במקרים אלה, ניתן לבצע …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH 5R01AI144149. הדמויות הסכמטיות נוצרו באמצעות BioRender.
Materials
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
参考文献
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis, and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).
- Laugel, B., et al. Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells. The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).
- Andreu, N., et al. Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis. Scientific Reports. 7, 42225 (2017).
- Roberts, A. W., et al. Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond. eLife. 8, e45957 (2019).
- Oberdoerffer, P., et al. Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages. Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).
- Ma, S., et al. YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells. Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, e00471 (2013).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).
- Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. University of California, Davis. , (2022).
- Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA. Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).
- Yu, X., et al. Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX. Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).
