使用电穿孔Cas9-sgRNA复合物对原代骨髓来源的巨噬细胞进行高效基因破坏
概要
该协议描述了使用 体外 组装并通过电穿孔递送的Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物在小鼠骨髓来源的巨噬细胞中进行基因组编辑的过程。
Abstract
来自小鼠的骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）是研究组织巨噬细胞复杂生物学的关键工具。作为原代细胞，它们比永生化的巨噬细胞系更接近 于体内 巨噬细胞的生理学模型，并且可以从已经携带特定遗传变化的小鼠中提取。然而，破坏BMDM的基因功能在技术上仍然具有挑战性。在这里，我们提供了一种在BMDM中进行高效CRISPR / Cas9基因组编辑的协议，该协议允许引入小的插入和缺失（插入缺失），从而导致破坏基因功能的移码突变。该方案描述了如何合成单向导RNA（sgRNA-Cas9）并形成纯化的sgRNA-Cas9核糖核蛋白复合物（RNP），这些复合物可以通过电穿孔递送。它还提供了一种使用常规 Sanger 测序和免费提供的在线分析程序来监控编辑效率的有效方法。该方案可在1周内进行，不需要质粒构建;它通常会导致 85% 到 95% 的编辑效率。
Introduction
巨噬细胞是先天免疫细胞，在组织修复和免疫中起关键作用 1,2。永生化的巨噬细胞系，如小鼠 RAW 264.7 细胞或人 THP-1 细胞，具有多种有益特性，包括通过递送 RNA 干扰或 CRISPR/Cas9 载体来促进生长和易于基因破坏 3,4。然而，致癌转化会显着改变它们的生理机能，这导致某些通路的异常激活和其他通路的沉默反应 5,6。原代骨髓来源的巨噬细胞 （BMDM） 更接近地概括了体内巨噬细胞的生理学，但由于这些原代免疫细胞中的质粒转染和病毒转导效率低，因此在遗传操作方面仍然具有挑战性 7,8。因此，需要更有效的方法来破坏基因功能。
CRISPR/Cas9 基因组编辑是跨一系列生物系统（包括哺乳动物细胞9、10、11、12）进行遗传操作的强大工具。化脓性链球菌 Cas9 蛋白与序列特异性向导 RNA 复合时可有效且特异性地切割双链 DNA。通过裂解 DNA 的非同源末端连接 （NHEJ） 进行 DNA 修复会导致小的插入或缺失（插入缺失），从而产生移码突变。在早期研究中，Cas9 和 sgRNA 通过质粒或慢病毒载体递送，这是许多细胞系的有效递送方法 9,10。然而，由于通过转染或转导递送载体的效率低，原代细胞，特别是原代免疫细胞通常对这些方法无效。随后，已经开发了在体外生成 sgRNA-Cas9 复合物并通过电穿孔递送它们的方法，这些方法在多种细胞类型中实现了高效率13,14。结果表明，使用这种方法在原代巨噬细胞中进行基因组编辑的可能性。
在这里，我们提供了一种使用 sgRNA-Cas9 核糖核蛋白复合物 （RNP） 在初级 BMDM 中进行基因组编辑的方案。它包含减轻原代免疫细胞中存在的免疫传感器激活的步骤，并以最小的毒性在靶向位点进行高达 95% 的编辑。该协议还包括使用常规聚合酶链反应 （PCR） 和 Sanger 测序评估编辑效率的工作流程，然后通过分解跟踪插入缺失 （TIDE）15（一种经过充分验证的在线软件工具）进行计算机分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
使用电穿孔Cas9-sgRNA复合物进行基因组编辑可以有效破坏BMDM中的基因功能。编辑效率因靶序列和基因而异。通常，通常会筛选四到五个 sgRNA，以鉴定出一种高活性的 sgRNA。一些基因座的编辑效率较低，很可能是由于染色质结构。在这些情况下，可以进行一些修改以提高编辑效率。将两个活性 sgRNA 共同递送至同一外显子可改善某些基因的编辑。然而，当两个向导共转染时，我们观察到 TIDE 可能会失?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由美国国立卫生研究院资助5R01AI144149资助。示意图是使用 BioRender 创建的。
Materials
| 3T3-MCSF Cell Line | Gift from Russell Vance | not applicable | |
| Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer | IDT | 1075915 | |
| Ampure XP Reagent Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | NEB | M0525S | |
| DNase | NEB | M0303S | |
| DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2) | Thermo Fisher | 14040-133 | |
| DPBS -Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190-144 | |
| ExoI | NEB | M0293S | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Corning | 35-015-CV | |
| Herculase DNA polymerase & buffer | Agilent | 600677 | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2040S | |
| LoBind conical tubes 15 mL | Eppendorf | 30122216 | |
| LoBind Eppendorf tubes 2 mL | Eppendorf | 22431102 | |
| NEBuffer r2.1 | NEB | B6002S | |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher | MPK5000, MPP100, MPS100 | |
| Neon Transfection System 10 uL Tips | Thermo Fisher | MPK1025 or MPK1096 | |
| PBS + 1mM EDTA | Lonza | BE02017F | |
| Proteinase K | Thermo Fisher | EO0491 | |
| rCutSmart Buffer for ExoI | NEB | B6004S | |
| Ribolock | Thermo Fisher | EO0384 | |
| RNA loading dye | NEB | B0363S | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| S. pyogenes Cas9-NLS | University of California Macro Lab | not applicable | Available to non-UC investigators through https://qb3.berkeley.edu |
| S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation | IDT | 1081059 | |
| SAP | NEB | M0371S |
参考文献
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