概要

Рецептура и характеристика биологически активного агента, содержащего нанодиски

Published: March 17, 2023
doi:

概要

Здесь мы описываем производство и характеристику биологически активных агентов, содержащих нанодиски. Нанодиски амфотерицина B взяты в качестве примера для поэтапного описания протокола.

Abstract

Термин нанодиск относится к дискретному типу наночастицы, состоящей из двухслойного липида, белка каркаса и интегрированного биологически активного агента. Нанодиски организованы в виде дискообразного липидного бислоя, периметр которого ограничен каркасным белком, обычно входящим в семейство обменных аполипопротеинов. Многочисленные гидрофобные биологически активные агенты были эффективно растворены в нанодисках путем их интеграции в гидрофобную среду липидного бислоя частицы, в результате чего образовалась в значительной степени однородная популяция частиц в диапазоне диаметром 10-20 нм. Составление нанодисков требует точного соотношения отдельных компонентов, соответствующего последовательного добавления каждого компонента с последующим ультразвуком в ванне смеси состава. Амфипатический каркасный белок спонтанно контактирует и реорганизует дисперсный бислой, образуя смесь липидов и биологически активных веществ, образуя дискретную однородную популяцию частиц нанодиска. Во время этого процесса реакционная смесь переходит от непрозрачного, мутного вида к осветленному образцу, который при полной оптимизации не дает осадка при центрифугировании. Характеризирующие исследования включают определение эффективности солюбилизации биологически активных веществ, электронную микроскопию, гель-фильтрационную хроматографию, ультрафиолетовую видимую (УФ/Vis) спектроскопию поглощения и/или флуоресцентную спектроскопию. Обычно за этим следует исследование биологической активности с использованием культивируемых клеток или мышей. В случае нанодисков, содержащих антибиотик (т.е. макролидный полиеновый антибиотик амфотерицин В), их способность ингибировать рост дрожжей или грибков в зависимости от концентрации или времени может быть измерена. Относительная простота составления, универсальность по отношению к составным частям, наноразмерный размер частиц, присущая стабильность и растворимость в воде позволяют применять технологию нанодисков in vitro и in vivo . В настоящей статье мы описываем общую методологию формулирования и характеристики нанодисков, содержащих амфотерицин B, в качестве гидрофобного биологически активного агента.

Introduction

Зарождающиеся дискоидальные липопротеины высокой плотности (ЛПВП) являются естественными предшественниками гораздо более распространенных сферических ЛПВП, присутствующих в системе кровообращения человека. Эти зарождающиеся частицы, также называемые пре-ß ЛПВП, обладают уникальными и отличительными структурными свойствами1. Действительно, вместо того, чтобы существовать как сфероидальная частица, зарождающиеся ЛПВП имеют форму диска. Обширные исследования структурных характеристик естественных и восстановленных дискоидальных ЛПВП показали, что они состоят из фосфолипидного бислоя, периметр которого ограничен амфипатическим обменным аполипопротеином (апо), таким как апоА-I. В метаболизме липопротеинов человека циркулирующие зарождающиеся ЛПВП накапливают липиды из периферических клеток и созревают в сферические ЛПВП в процессе, который зависит от ключевых белковых медиаторов, включая кассетный транспортер A1, связывающий АТФ, и лецитин: холестерин ацилтрансферс2. Этот процесс представляет собой важнейший компонент обратного пути транспорта холестерина, который считается защитным от сердечных заболеваний. Вооружившись этими знаниями и способностью восстанавливать дискоидальные ЛПВП, исследователи использовали эти частицы в качестве терапевтического вмешательства для лечения атеросклероза3. По сути, вливание восстановленного ЛПВП (рЛПВП) пациентам способствует оттоку холестерина из отложений бляшек и возвращает его в печень для превращения в желчные кислоты и выведения из организма. Несколько биотехнологических/фармацевтических компаний придерживаются этой стратегии лечения4.

В то же время способность генерировать эти частицы в лаборатории вызвала шквал исследовательской деятельности, которая привела к новым приложениям и новым технологиям. Одно из известных применений включает использование частиц рЛПВП в качестве миниатюрной мембраны для размещения трансмембранных белков в нативной среде5. На сегодняшний день сотни белков были успешно включены в дискоидальный рЛПВП, и исследования показали, что эти белки сохраняют как нативную конформацию, так и биологическую активность в качестве рецепторов, ферментов, транспортеров и т. д. Также было показано, что эти частицы, называемые «нанодисками», поддаются структурной характеристике, часто с высоким разрешением6. Этот подход к исследованиям трансмембранных белков признан превосходящим исследования с моющими мицеллами или липосомами и, как следствие, быстро развивается. Важно признать, что сообщалось о двух различных методах, способных формировать рЛПВП. Метод «холатного диализа»13 популярен для применений, связанных с включением трансмембранных белков в бислой5 рЛПВП. По существу, этот способ приготовления включает смешивание двухслойного фосфолипида, белка каркаса и трансмембранного белка, представляющего интерес, в буфере, содержащем детергент холат натрия (или дезоксихолат натрия; молекулярная масса мицеллы [MW] 4,200 Да). Моющее средство эффективно растворяет различные компоненты реакции, позволяя диализовать образец против буфера, в котором отсутствует моющее средство. На этапе диализа, когда моющее средство удаляется из образца, спонтанно образуется рЛПВП. Когда этот подход используется для захвата интересующего трансмембранного белка, частицы продукта были названы нанодисками5. Однако попытки использовать этот метод для включения низкомолекулярных гидрофобных биологически активных агентов (MW <1000 Da) были в значительной степени безуспешными. В отличие от трансмембранных белков, низкомолекулярные биологически активные агенты способны выходить из диализного мешка вместе с детергентом, что значительно снижает эффективность их включения в рЛПВП. Эта проблема была решена путем исключения моющих средств из рецептурной смеси14. Вместо этого компоненты добавляют в водный буфер последовательно, начиная с бислоя, образующего липид, образуя стабильный биологически активный агент, содержащий рЛПВП, называемый нанодиском. Другие использовали рЛПВП для включения и транспортировки агентов визуализации in vivo 7. Совсем недавно специализированные рЛПВП, состоящие из каркаса аполипопротеина и анионного глицерофосфолипида, кардиолипина, использовались в исследованиях связывания лигандов. Эти частицы обеспечивают платформу для исследований взаимодействия кардиолипина с различными водорастворимыми лигандами, включая кальций, цитохром с и противоопухолевый агент доксорубицин8.

Основное внимание в настоящем исследовании уделяется составлению рЛПВП, которые обладают стабильно включенным гидрофобным биологически активным агентом (т.е. нанодиском). Способность этих агентов интегрироваться в липидную среду дискоидальных частиц рЛПВП эффективно придает им растворимость в воде. Таким образом, нанодиски имеют потенциал для терапевтического применения in vivo . При разработке нанодисков требуются определенные условия инкубации/реакции для успешного включения дискретных гидрофобных биологически активных агентов в частицу продукта, и целью этого отчета является предоставление подробной практической информации, которая может быть использована в качестве основополагающего шаблона для создания новых частиц нанодисков для конкретных применений. Таким образом, в контексте данной рукописи термины «нанодиск» и «нанодиск» не являются взаимозаменяемыми. В то время как нанодиск относится к рЛПВП, разработанному для содержания трансмембранного белка, встроенного в его липидный бислой5, термин нанодиск относится к рЛПВП, разработанному для включения низкомолекулярных (< 1000 Да) гидрофобных биологически активных агентов, таких как амфотерицин В14.

Существует множество методов получения подходящих белков каркаса. Можно приобрести каркасные белки у производителей [например, apoA-I (SRP4693) или apoE4 (A3234)], однако стоимость может быть ограничивающим фактором. Предпочтительным подходом является экспрессия рекомбинантных белков каркаса в Escherichia coli. Опубликованы протоколы для человека apoA-I9, apoE410, а также белка гемолимфы насекомых аполипофорина-III11. Для целей экспериментов, описанных в настоящем описании, использовали рекомбинантный N-концевой (NT) домен человека apoE4 (аминокислоты 1-183). Нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий apoE4-NT, была синтезирована и вставлена в вектор экспрессии pET-22b (+), непосредственно примыкающий к векторно-кодируемой лидерной последовательности pelB. Эта конструкция приводит к экспрессии белка слияния лидерной последовательности pelB – apoE4-NT. После синтеза белка бактериальная лидерная последовательность pelB направляет вновь синтезированный белок в периплазматическое пространство, где пептидаза-лидер расщепляет последовательность pelB. Полученный белок apoE4-NT без меток последовательности или хвостов впоследствии ускользает от бактерий и накапливается в питательной среде11,12, упрощая последующую обработку.

Protocol

1. Трансформация, экспрессия и очистка белкового компонента каркаса Бактериальная трансформация BL21 с помощью плазмиды, содержащей apoE4-NTРазморозьте пробирку с компетентными ячейками BL21 (DE3) на льду в течение 10 мин. Как только весь лед растает, аккуратно и осторожн…

Representative Results

Процесс создания нанодисков с биологически активными веществамиВ описанной процедуре приготовления ampB-нанодиска реакция считается завершенной, когда внешний вид образца переходит от мутного к прозрачному (рис. 1). Это изменение указывает на то, что образова…

Discussion

Рецептура биологически активного агента, содержащего нанодиски, обеспечивает удобный метод растворения нерастворимых гидрофобных соединений. Поскольку нанодиски биологически активного агента продукта полностью растворимы в водных средах, они обеспечивают полезный способ доставки…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения (R37 HL-64159).

Materials

Amphotericin B Cayman Chemical Company 11636 ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin Fisher Scientific BP17925 Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid GenScript N/A Transformation
Baffled Flask New Brunswick Scientific N/A Expansion & Expression
BL21 competent E coli New England Biolabs C2527I Transformation
Centrifuge bottles Nalgene 3140-0250 Expression
Chloroform Fisher Scientific G607-4 ND Formulation
DMSO Sigma Aldrich 472301 Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine Avanti Lipids 850345P ND Formulation
Erlenmeyer flask Bellco Biotechnology N/A Expansion & Expression
Falcon Tubes Sarstedt Ag & Co D51588 Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes VWR 47729-570 ND Formulation
GraphPad (Software) Dotmatics N/A Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath VWR N/A ND Formulaton
Heating and Nitrogen module Thermo Scientific TS-18822 ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL) GE Healthcare 17-0407-03 Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside  Fisher Scientific BP1755 Expression
J-25 Centrifuge Beckman Coulter J325-IM-2 Expression
JA-14 Rotor Beckman Coulter 339247 Expression
Lyophilizer Labconco 7755030 ND Formulation
Methanol Fisher Scientific A452-4 ND Formulation
Nitrogen gas Praxair UN1066 ND Formulation
NZCYM media RPI Research Products N7200-1000.0 Expansion & Expression
Pet-22B vector GenScript N/A Transformation
Petri dish Fisher Scientific FB0875718 Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes Fisher Brand 14385 928A Spectral Analysis
Shaking Incubator New Brunswick Scientific M1344-0004 Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys Thermo Scientific 66430 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 68100 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 88243 Purification
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Purification
Sodium Phosphate dibasic Fisher Scientific S374-500 Purification
Sodium Phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-500 Purification
Spectra/POR Weighted Closures Spectrum Medical Industries 132736 Purification
Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 220-92961-01 spectral analysis
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 366816 ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software) Shimadzu N/A Spectral Analysis
Vacuum filter Millipore 9004-70-0 Expression & Purification
Vacuum pump GAST Manufacturing Inc DOA-P704-AA Expression & Purification
Vortex Fisher Scientific 12-812 ND Formulation
Yeast N/A BY4741 Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose BD 242820 Yeast Viability Assay

参考文献

  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. HDL maturation and remodelling. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).
  3. Nicholls, S. J., et al. Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).
  4. Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. HDL-targeted therapies: progress, failures and future. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).
  5. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).
  6. Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A. eLife. 11, e81704 (2022).
  7. Pérez-Medina, C., et al. PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles. Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).
  8. Fox, C. A., Ryan, R. O. Studies of the cardiolipin interactome. Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).
  9. Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I. Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).
  10. Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).
  11. Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein. Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).
  12. Fisher, C. A., et al. Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E. Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).
  13. Jonas, A. Reconstitution of high-density lipoproteins. Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).
  14. Ryan, R. O. Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).
  15. Oda, M. N., et al. Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B. Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).
  16. Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. All-trans-retinoic acid nanodisks. International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).
  17. Ghosh, M., et al. Curcumin nanodisks: formulation and characterization. Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).
  18. Yuan, Y., et al. Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin. International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).
  19. Zhao, P., et al. Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway. Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).
  20. Moschetti, A., et al. Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles. Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).
  21. Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).
  22. Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage. Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).
  23. Scheetz, L. M., et al. Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).
  24. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature Communications. 5, 3065 (2014).
  25. Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).
  26. Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. Peptide stabilized amphotericin B nanodisks. Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).
  27. Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).
  28. Nguyen, T. S., et al. Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).
  29. Ryan, R. O. Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein. Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).
  30. Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).
  31. Crosby, N. M., et al. Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas. Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).
  32. Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle. Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).
  33. Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).
  34. Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).
  35. Fox, C. A., Ryan, R. O. Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin. Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).
  36. Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).

Play Video

記事を引用
Lethcoe, K., Fox, C. A., Moh, I., Swackhamer, M., Karo, M., Lockhart, R., Ryan, R. O. Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks. J. Vis. Exp. (193), e65145, doi:10.3791/65145 (2023).

View Video