概要

Formulação e caracterização de agentes bioativos contendo nanodiscos

Published: March 17, 2023
doi:

概要

Aqui, descrevemos a produção e caracterização de agentes bioativos contendo nanodiscos. Os nanodiscos de anfotericina B são tomados como exemplo para descrever o protocolo de forma escalonada.

Abstract

O termo nanodisco refere-se a um tipo discreto de nanopartícula composto por uma bicamada formando lipídio, uma proteína de andaime e um agente bioativo integrado. Os nanodiscos são organizados como uma bicamada lipídica em forma de disco cujo perímetro é circunscrito pela proteína do andaime, geralmente um membro da família das apolipoproteínas trocáveis. Numerosos agentes bioativos hidrofóbicos têm sido eficientemente solubilizados em nanodiscos por sua integração no meio hidrofóbico da bicamada lipídica da partícula, produzindo uma população amplamente homogênea de partículas na faixa de 10-20 nm de diâmetro. A formulação de nanodiscos requer uma proporção precisa de componentes individuais, uma adição sequencial apropriada de cada componente, seguida de sonicação em banho da mistura de formulação. A proteína do arcabouço anfipático entra em contato espontaneamente e reorganiza a bicamada dispersa formando mistura lipídico/agente bioativo para formar uma população discreta e homogênea de partículas de nanodisco. Durante esse processo, a mistura de reação faz a transição de uma aparência opaca e turva para uma amostra clarificada que, quando totalmente otimizada, não produz precipitado após a centrifugação. Estudos de caracterização envolvem a determinação da eficiência de solubilização de agentes bioativos, microscopia eletrônica, cromatografia de filtração em gel, espectroscopia de absorbância no ultravioleta visível (UV/Vis) e/ou espectroscopia de fluorescência. Isto é normalmente seguido por uma investigação da actividade biológica utilizando células cultivadas ou ratinhos. No caso de nanodiscos que abrigam um antibiótico (isto é, o antibiótico polieno macrolídeo anfotericina B), sua capacidade de inibir o crescimento de leveduras ou fungos em função da concentração ou do tempo pode ser medida. A relativa facilidade de formulação, versatilidade em relação às partes componentes, tamanho de partícula em nanoescala, estabilidade inerente e solubilidade aquosa permitem inúmeras aplicações in vitro e in vivo da tecnologia de nanodiscos. No presente artigo, descrevemos uma metodologia geral para formulação e caracterização de nanodiscos contendo anfotericina B como agente bioativo hidrofóbico.

Introduction

As lipoproteínas discoidais nascentes de alta densidade (HDLs) são progenitores naturais da HDL esférica muito mais abundante presente no sistema circulatório humano. Essas partículas nascentes, também chamadas de HDL pré-ß, possuem propriedades estruturais únicas e distintas1. De fato, em vez de existir como uma partícula esferoidal, as HDLs nascentes são em forma de disco. Extensos estudos de caracterização estrutural das HDLs discoidais naturais e reconstituídas têm revelado que elas são compostas por uma bicamada fosfolipídica cujo perímetro é circunscrito por uma apolipoproteína anfipática trocável (apo), como a apoA-I. No metabolismo das lipoproteínas humanas, as HDLs nascentes circulantes acumulam lipídios das células periféricas e amadurecem em HDLs esféricas em um processo que é dependente de mediadores proteicos chave, incluindo o transportador de de ligação de ATP A1 e lecitina:colesterol aciltransferse2. Esse processo representa um componente crítico da via de transporte reverso do colesterol, considerada protetora contra doenças cardíacas. Munidos desse conhecimento e da capacidade de reconstituir HDLs discoidais, pesquisadores têm empregado essas partículas como intervenção terapêutica no tratamento da aterosclerose3. Em essência, a infusão de HDL reconstituído (rHDL) em pacientes promove o efluxo de colesterol dos depósitos de placa e o devolve ao fígado para conversão em ácidos biliares e excreção do corpo. Várias empresas biotecnológicas/farmacêuticas estão adotando essa estratégia de tratamento4.

Ao mesmo tempo, a capacidade de gerar essas partículas em laboratório desencadeou uma enxurrada de atividades de pesquisa que levaram a novas aplicações e novas tecnologias. Uma aplicação proeminente envolve o uso de partículas de rHDL como membrana em miniatura para abrigar proteínas transmembrana em um ambiente nativo5. Até o momento, centenas de proteínas foram incorporadas com sucesso no rHDL discoidal, e a pesquisa demonstrou que essas proteínas retêm tanto a conformação nativa quanto a atividade biológica como receptores, enzimas, transportadores, etc. Essas partículas, denominadas “nanodiscos”, também têm se mostrado passíveis de caracterização estrutural, muitas vezes em alta resolução6. Essa abordagem para investigações de proteínas transmembrana é reconhecida como superior aos estudos com micelas ou lipossomas em detergente e, como resultado, está avançando rapidamente. É importante reconhecer que dois métodos distintos têm sido relatados que são capazes de formar uma rHDL. O método de “diálise por colato”13 é popular para aplicações relacionadas à incorporação de proteínas transmembrana na bicamada rHDL5. Essencialmente, este método de formulação envolve a mistura de uma bicamada formando fosfolipídio, uma proteína de andaime e a proteína transmembrana de interesse em um tampão contendo o detergente colato de sódio (ou desoxicolato de sódio; peso molecular da micela [PM] de 4.200 Da). O detergente solubiliza eficazmente os diferentes componentes da reação, permitindo que a amostra seja dialisada contra tampão sem detergente. Durante a etapa de diálise, à medida que o detergente é retirado da amostra, forma-se espontaneamente um HDLr. Quando essa abordagem é usada para aprisionar uma proteína transmembrana de interesse, as partículas do produto têm sido denominadas nanodiscos5. Tentativas de usar esse método para incorporar agentes bioativos hidrofóbicos de pequenas moléculas (MW <1.000 Da), no entanto, têm sido em grande parte malsucedidas. Ao contrário das proteínas transmembrana, os agentes bioativos de pequenas moléculas são capazes de escapar da bolsa de diálise junto com o detergente, diminuindo consideravelmente sua eficiência de incorporação nas rHDLs. Esse problema foi resolvido com a omissão de detergentes da mistura da formulação14. Em vez disso, os componentes são adicionados a um tampão aquoso sequencialmente, começando com a bicamada formando lipídio, formando um agente bioativo estável contendo rHDL, referido como um nanodisco. Outros utilizaram a rHDL para incorporação e transporte de imagiologia in vivo 7. Mais recentemente, a rHDL especializada composta por um arcabouço apolipoprotéico e o glicerofosfolipídeo aniônico, cardiolipina, tem sido empregada em estudos de ligação de ligantes. Essas partículas fornecem uma plataforma para estudos da interação da cardiolipina com vários ligantes solúveis em água, incluindo cálcio, citocromo c e o agente anticâncer doxorrubicina8.

O foco do presente estudo está na formulação de rHDL que possuam um agente bioativo hidrofóbico incorporado de forma estável (i.e. nanodisco). A capacidade desses agentes de se integrarem ao meio lipídico das partículas de rHDL discoidal lhes confere solubilidade aquosa. Como tal, os nanodiscos têm potencial para aplicações terapêuticas in vivo . Ao formular nanodiscos, condições específicas de incubação/reação são necessárias para incorporar com sucesso agentes bioativos hidrofóbicos discretos na partícula do produto, e o objetivo deste relatório é fornecer informações práticas detalhadas que podem ser usadas como um modelo fundamental para a criação de novas partículas de nanodiscos para aplicações específicas. Assim, no contexto deste manuscrito os termos nanodisco e nanodisco não são intercambiáveis. Enquanto nanodisco refere-se a um rHDL formulado para conter uma proteína transmembrana embutida em sua bicamada lipídica5, o termo nanodisco refere-se a um rHDL formulado para incorporar agentes bioativos hidrofóbicos de baixo peso molecular (< 1.000 Da), como a anfotericina B14.

Uma variedade de métodos está disponível para a aquisição de proteínas adequadas do arcabouço. É possível comprar proteínas de andaimes de fabricantes [por exemplo, apoA-I (SRP4693) ou apoE4 (A3234)], no entanto, o custo pode ser um fator limitante. Uma abordagem preferida é expressar proteínas recombinantes do arcabouço em Escherichia coli. São publicados protocolos para apoA-I9, apoE410 e apolipoforina-III humana e para a proteína de hemolinfa de insetos apolipoforina-III11. Para os experimentos aqui descritos, foi utilizado o domínio N-terminal (NT) humano recombinante da apoE4 (aminoácidos 1-183). A sequência de nucleotídeos que codifica apoE4-NT humana foi sintetizada e inserida em um vetor de expressão pET-22b (+) diretamente adjacente à sequência líder pelB codificada vetorialmente. Este construto leva à expressão de uma proteína de fusão da sequência líder da pelB-apoE4-NT. Após a síntese proteica, a sequência líder da pelB bacteriana direciona a proteína recém-sintetizada para o espaço periplasmático, onde a peptidase líder cliva a sequência da pelB. A proteína apoE4-NT resultante, sem tags de sequência ou caudas, posteriormente escapa da bactéria e se acumula no meio de cultura11,12, simplificando o processamento a jusante.

Protocol

1. Transformação, expressão e purificação do componente proteico do andaime Transformação bacteriana BL21 com apoE4-NT contendo plasmídeoDescongelar um tubo de células competentes BL21 (DE3) no gelo por 10 min. Depois que todo o gelo derreter, misture suave e cuidadosamente pipetar 50 μL das células em um tubo de transformação sobre gelo. Adicionar 5 μL contendo 50 ng de ADN plasmidial (para sequência, ver quadro suplementar 1) à mi…

Representative Results

Processo de formulação de nanodiscos de agentes bioativosNo procedimento de formulação de ampB-nanodisco descrito, a reação é considerada completa quando a aparência da amostra transita de turva para clara (Figura 1). Essa alteração indica que nanodiscos se formaram e que o agente bioativo foi solubilizado. Muitas vezes, os agentes bioativos absorvem luz na região do comprimento de onda visível (por exemplo, ampB, curcumina, luteína, coenzima Q10)…

Discussion

A formulação de um agente bioativo contendo nanodiscos fornece um método conveniente para solubilizar compostos hidrofóbicos insolúveis. Como os nanodiscos do agente bioativo do produto são totalmente solúveis em meio aquoso, eles fornecem um método de liberação útil para uma ampla gama de moléculas hidrofóbicas (Tabela 1). Estes incluem pequenas moléculas, drogas naturais e sintéticas, fitonutrientes, hormônios, etc. A estratégia de formulação geralmente segue um protocolo padrão que…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do National Institutes of Health (R37 HL-64159).

Materials

Amphotericin B Cayman Chemical Company 11636 ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin Fisher Scientific BP17925 Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid GenScript N/A Transformation
Baffled Flask New Brunswick Scientific N/A Expansion & Expression
BL21 competent E coli New England Biolabs C2527I Transformation
Centrifuge bottles Nalgene 3140-0250 Expression
Chloroform Fisher Scientific G607-4 ND Formulation
DMSO Sigma Aldrich 472301 Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine Avanti Lipids 850345P ND Formulation
Erlenmeyer flask Bellco Biotechnology N/A Expansion & Expression
Falcon Tubes Sarstedt Ag & Co D51588 Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes VWR 47729-570 ND Formulation
GraphPad (Software) Dotmatics N/A Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath VWR N/A ND Formulaton
Heating and Nitrogen module Thermo Scientific TS-18822 ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL) GE Healthcare 17-0407-03 Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside  Fisher Scientific BP1755 Expression
J-25 Centrifuge Beckman Coulter J325-IM-2 Expression
JA-14 Rotor Beckman Coulter 339247 Expression
Lyophilizer Labconco 7755030 ND Formulation
Methanol Fisher Scientific A452-4 ND Formulation
Nitrogen gas Praxair UN1066 ND Formulation
NZCYM media RPI Research Products N7200-1000.0 Expansion & Expression
Pet-22B vector GenScript N/A Transformation
Petri dish Fisher Scientific FB0875718 Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes Fisher Brand 14385 928A Spectral Analysis
Shaking Incubator New Brunswick Scientific M1344-0004 Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys Thermo Scientific 66430 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 68100 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 88243 Purification
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Purification
Sodium Phosphate dibasic Fisher Scientific S374-500 Purification
Sodium Phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-500 Purification
Spectra/POR Weighted Closures Spectrum Medical Industries 132736 Purification
Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 220-92961-01 spectral analysis
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 366816 ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software) Shimadzu N/A Spectral Analysis
Vacuum filter Millipore 9004-70-0 Expression & Purification
Vacuum pump GAST Manufacturing Inc DOA-P704-AA Expression & Purification
Vortex Fisher Scientific 12-812 ND Formulation
Yeast N/A BY4741 Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose BD 242820 Yeast Viability Assay

参考文献

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記事を引用
Lethcoe, K., Fox, C. A., Moh, I., Swackhamer, M., Karo, M., Lockhart, R., Ryan, R. O. Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks. J. Vis. Exp. (193), e65145, doi:10.3791/65145 (2023).

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