Burada, kısa ömürlü omurgalı model Nothobranchius furzeri’nin beyinlerinden çekirdekleri izole etmek için tek çekirdekli RNA dizilimi veya dizileme ile transpozaz erişimli kromatin için tek çekirdekli tahlil (ATAC-seq) gibi aşağı akış uygulamaları için bir protokol sunuyoruz.
Omurgalı sistemlerinde tek hücreli çözünürlükte beyin yaşlanmasını incelemek, maliyet, zaman ve teknik kısıtlamalar nedeniyle zor olmaya devam etmektedir. Burada, doğal olarak kısa ömürlü omurgalı Afrika turkuaz killifish Nothobranchius furzeri’nin beyinlerinden tek çekirdekli RNA dizileme (snRNA-seq) kütüphaneleri oluşturmak için bir protokol gösteriyoruz. Afrika turkuaz killifish, 4-6 aylık bir ömre sahiptir ve uygun maliyetli bir şekilde barındırılabilir, böylece omurgalı beyin yaşlanmasını incelemek için maliyet ve zaman engellerini azaltır. Bununla birlikte, genç ve yaşlı balıkların beyninden aşağı akış tek hücreli deneyler için yeterli kalitede çekirdekleri izole etmek için özel protokollere ihtiyaç vardır. Burada, yüksek kaliteli tek çekirdekli omik kütüphanelerin oluşturulmasında kritik bir adım olan yetişkin Afrika turkuaz killifish’in beyninden yüksek kaliteli çekirdeklerin izolasyonu için ampirik olarak optimize edilmiş bir protokol gösteriyoruz. Ayrıca, kirletici arka plan RNA’sını azaltma adımlarının, hücre tiplerini açıkça ayırt etmek için önemli olduğunu gösteriyoruz. Özetle, bu protokol geleneksel olmayan omurgalı model organizmalarda beyin yaşlanmasını incelemenin fizibilitesini göstermektedir.
Omurgalı beyin yaşlanmasının mekanizmalarını anlamak, Alzheimer ve demans 1 gibi yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıkların ele alınmasında kritik önemesahiptir. Afrika turkuaz killifish (Nothobranchus furzeri), esaret altında yetiştirilebilecek en kısa ömürlü omurgalıdır ve kısa ömrü ve yaşa bağlı bilişsel bozukluğu nedeniyle, mükemmel bir beyin yaşlanma modelidir 2,3,4,5. Son zamanlarda, tek çekirdekli RNA-seq (snRNA-seq) ve dizileme ile transpozaz erişimli kromatin için tek çekirdek testi (snATAC-seq) gibi tek hücreli “omik” teknolojilerinin ortaya çıkması, araştırmacıların yaşlanan beyni benzeri görülmemiş bir çözünürlükte sorgulamalarına izin vermiştir 6,7,8. Bu yöntemler çekirdek izolasyonuna dayanır, çünkü nöronlar gibi beyin hücrelerinin iyileşmesi genellikle 6,7,8,9,10’u izole etmek için çok zordur. Bununla birlikte, yayınlanan çekirdek izolasyon protokollerinin çoğu, memeli model organizmalar11,12,13,14,15 için optimize edilmiştir. Bu nedenle, şu anda yaşlanma araştırması2 alanında gelecek vaat eden yeni bir model organizma olarak killifish’teki beyin çekirdeklerini izole etmek için karşılanmamış bir ihtiyaç olduğundan, bu protokolün amacı, yüksek kaliteli çekirdekleri donmuş beyin killifish dokusundan izole etmek için bir yöntem oluşturmaktır.
Burada, yüksek kaliteli çekirdekleri killifish beyinlerinden izole etmek için yaygın olarak bulunan malzemeleri kullanan akıcı ve sağlam bir iş akışı oluşturulmuştur. Bu protokol, Afrika turkuaz killifish’in düşük miyelin içerikli beyinlerine, donmuş dokunun kırılganlığına ve dizileme ile ilgili uygulamalar için ortam enkaz içeriğini azaltma ihtiyacına uyum sağlamak için fare beyinleri için 10x Genomik protokolünden değiştirildi16. Gerçekten de, memeli beyin dokusu17,18 için daha önce optimize edilmiş protokoller, dondurulmuş killifish beyinlerinde kullanıldığında düşük çekirdek kalitesine (yani aşırı liziz) ve / veya yüksek enkaz içeriğine yol açarak, mikroakışkanlar kullanan tek çekirdekli RNA-seq önerilerine göre snRNA-seq ile kullanım için uygun değildir (Ek Şekil 1).
Çekirdek izolasyonuna ek olarak, mikroskopi ve akış sitometrisi ile çekirdek kalitesinin ve veriminin nasıl değerlendirileceğini gösteriyoruz. Bu makalede, hem en iyi hem de en uygun olmayan sonuçlara örnekler sağlanmakta ve sorun giderme anlatılmaktadır. Bu protokol, dondurulmuş killifish beyinleri için tasarlanmış ve optimize edilmiştir, ancak taze disseke edilmiş killifish örneklerinde büyük değişiklikler yapılmadan da kullanılabilir. Bu yöntem kullanılarak izole edilen Killifish beyin çekirdekleri, aşağı akış uygulaması olarak tek çekirdekli RNA-seq’te (snRNA-seq) kullanım için optimize edilmiştir, ancak snATAC-seq ve bulk ATAC-seq’te kullanım için de uygun olmalıdır.
Burada sunulan protokol, killifish beyinlerinden yüksek kaliteli çekirdekleri yeniden üretmek için kullanılabilir. Bu protokolün killifish beyni için özel olarak tasarlanması gerekiyordu, çünkü killifish beyinlerine uygulanan tipik memeli tabanlı beyin çekirdeği izolasyon protokolleri sürekli olarak elimizde düşük çekirdek kalitesine neden oldu. Bunun, killifish beyninin memeli meslektaşlarına kıyasla daha düşük göreceli miyelin içeriğinden kaynaklandığından şüpheleniyoruz, bu da memeli beyin hücresi lizisi için gerekli olan sert koşullara yanıt olarak lize olacak ve kümelenecektir. Bu protokol, omurgalı beyin yaşlanmasının maliyet ve zaman etkin bir modelinde tek hücre düzeyinde beyin yaşlanmasının araştırılmasını kolaylaştırdığı için yaşlanma ve killifish alanlarında bir ilerlemedir.
Bu protokol taze veya dondurulmuş numuneler için sağlamdır, ancak taze veya dondurulmuş doku kullanırken aşağı akış uygulamaları dikkate alınmalıdır. Dondurulmuş doku, numuneler toplanırken aylarca toplanıp saklanabildiği için genellikle uygundur. Bu tür numuneler snRNA-seq gibi uygulamalar için güvenle kullanılabilir. Bununla birlikte, numunelerin dondurulması nükleer yapıyı ve dolayısıyla ATAC-seq21 ile kromatin manzarasını doğru bir şekilde ölçme yeteneğini bozabilir. Bu nedenle, toplu ATAC-seq veya snATAC-seq gibi aşağı akış uygulamaları için, donmuş beyinler yerine taze disseke edilmiş beyinlerin kullanılması önerilir. Ek olarak, beyin homojenizasyonundan sonraki tüm adımlar paralel olarak gerçekleştirilebildiğinden, bu protokol makul bir zaman diliminde birden fazla numunenin çalıştırılmasına uygundur, böylece buz üzerinde uzun süreli inkübasyonun neden olduğu RNA bozulmasını sınırlar.
Ayrıca, çekirdek ekstraksiyonu yapıldıktan sonra tamponların taze (saatler içinde) hazırlanması zorunludur. BSA’nın yanı sıra deterjanların da protokole başlamadan hemen önce tamponlara eklenmesi gerektiğini bulduk. Sadece tuz (PBS, NaCl, vb.) içeren tamponlar konsantre olarak yapılabilir, filtre sterilize edilebilir (0,22 μm) ve oda sıcaklığında süresiz olarak saklanabilir. BSA stok çözeltileri, çekirdek ekstraksiyonundan sonraki günler içinde (bir tozdan hazırlanmışsa) 4 ° C’de hazırlanabilir, sterilize edilebilir ve saklanabilir, ancak protokolü üstlenmeden hemen önce bu protokolde kullanılan tamponlara her zaman eklenmelidir. Ancak BSA çözümlerinin protokol gününde hazırlanmasını öneririz. Üçüncü bir taraftan önceden hazırlanmış BSA çözeltileri kullanılıyorsa, taze, açılmamış şişelerin kullanılması tavsiye edilir. Taze BSA kullanımı genellikle çekirdek hazırlıklarında daha düşük enkaz içeriğine yol açar.
Taze veya dondurulmuş numuneler girdi olarak kullanılsa da, çekirdek izolasyonunu takiben çekirdek kalitesini değerlendirmek önemlidir. Bu protokol aşırı lizi önlemek için özel olarak tasarlanmış olsa da, çekirdek kalitesi kaybının en yaygın nedeni budur. Aşırı lizis, lizis tamponunda çok fazla zaman harcanmasından, standart bir delikli pipet ucuyla aşırı pipetleme gibi çekirdeklerin aşırı kaba işlenmesinden veya çekirdek izolasyonu ile aşağı akış uygulamaları arasında (>1 saat) aşırı miktarda zaman harcanmasından kaynaklanabilir. Aşırı lize edilmiş çekirdekler genellikle DNA’yı sızdıran ve kümelenmeye neden olan hasarlı nükleer çevrelere sahip olacaktır (Şekil 2B). Bu, artan sayıda multiplete yol açacak ve aşağı akış uygulamalarına, özellikle snRNA-seq’e müdahale edecek arka plan nükleik asitlerine katkıda bulunacaktır. Her iki nitelik de çekirdek izolasyonunu takiben mikroskopi ile değerlendirilebilir. Aşırı nükleer kümelenme gözlenirse, aşırı lizis olasılığını azaltmak için lizis adımı inkübasyonunu kısaltmaya çalışmanızı öneririz. Çekirdek singlet’larını arttırmak için alternatif bir yöntem olarak, floresan destekli hücre sıralama (FACS), bu protokolün aşağı akış yönündeki tekletleri zenginleştirmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, donmuş dokudan zaten kırılgan çekirdeklerle çalışırken, ayıklama sırasında meydana gelen kesme stresinin nükleer kopmanın artmasına ve dolayısıyla ortam RNA / DNA’sının artmasına neden olabileceğini not ediyoruz. Ek olarak, birden fazla numuneyi işlerken çekirdekler için bir FACS verim sıralaması çalıştırmak için gereken sürenin, diğer numuneler sıralanırken tüm çekirdek numunelerinin saatlerce buz üzerinde kalmasını gerektireceğini not ediyoruz. Bu nedenle, FACS yaklaşımına paralel olarak birden fazla numuneyi işlerken artan bekleme süreleri, genel olarak azalmış çekirdek kalitesine yol açabilir ve RNA bozulma riskini artırabilir. Bu nedenle, eğer FACS azaltılmış çift oran için isteniyorsa, verim sıralamasından sonra enkaz içeriğinin tekrar kontrol edilmesini ve potansiyel bir uyarı olarak tek hücreli RNA-seq uygulamaları için olası düşük RNA kalitesinin dikkate alınmasını öneririz.
Çekirdek sayılarının ve singlet oranının doğru bir tahmini, neredeyse tüm aşağı akış “omik” uygulamaları için gereklidir ve son derece önemlidir. Çekirdekleri boyutlarına göre kolayca geçit ve sayma yeteneği nedeniyle, akış sitometrisi, değerlendirdiğimiz çekirdekleri saymanın en doğru yöntemidir. Alternatif olarak, Invitrogen’in Kontes 2 FL Otomatik Hücre Sayacı veya DeNovix CellDrop Otomatik Hücre Sayacı gibi hücre sayaçlarını kullanarak çekirdekleri ölçebilir. Not etmek gerekirse, Invitrogen’in Kontes 2 FL Otomatik Hücre Sayacı ve çok daha az ölçüde DeNovix, enkazı çekirdek olarak sayarak çekirdek sayılarını abartma eğilimindedir, bu da manuel boyut geçidinin gerekli olabileceği anlamına gelir. Ayrıca, akış sitometresi, çekirdeğin saflığını kolayca değerlendirmesini sağlar. Tekli çekirdeklerin multiplet çekirdeklere karşı göreceli oranını, mikroskopi ile zor olan nicel bir şekilde ayırt edebilir. Bu, snRNA-seq ve snATAC-seq için hayati öneme sahiptir, çünkü bu protokoller, aşağı akış analizlerinin dışında tutulması gereken çoklu numune fazlalığından muzdarip olacaktır. Çokluklara ek olarak, “enkaz” ın (parçalanmış çekirdekler, hücresel enkaz) göreceli oranı, akış sitometrisi ile ölçülebilir ve nispeten düşük olmalıdır, çünkü bu malzeme genellikle bir arka plan sinyaline katkıda bulunabilecek ve tek çekirdek “omik” verilerini bozabilecek kirletici nükleik asitler içerir.
Daha önce tarif edilen çekirdek izolasyon protokollerinde olduğu gibi, orijinal dokudaki hücre tiplerinin oranları, çekirdek hazırlığı19’da sadık bir şekilde özetlenmeyebilir ve bu nedenle dikkatle yorumlanmalıdır. Tüm teleostlar gibi, Afrika turkuaz killifish, çekirdek hazırlığında da temsil edilmesi beklenen çekirdekli eritrositlere sahiptir. Bu çekirdekler, snRNA-seq ve snATAC-seq veri kümelerinde, hemoglobin genlerinin daha yüksek ekspresyonu/erişilebilirliği ile tanımlanabilir ve istenirse hesaplamalı olarak dışlanabilir.
The authors have nothing to disclose.
Bazı paneller BioRender.com ile oluşturuldu. Laboratuvarımızdaki bu çalışma, B.T.’ye NIA T32 AG052374 Doktora Sonrası Eğitim Bursu, Simons Yaşlanma Beyinde Plastisite için Simons İşbirliği’nin bir parçası olarak Simons Vakfı’ndan bir hibe, Navigage Vakfı’ndan bir pilot hibe ve B.A.B.’ye Hanson-Thorell Ailesi ödülü ile desteklenmiştir.
0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
Hydrochloric Acid | Sigma-Alrdich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |