Aqui apresentamos um protocolo para isolar núcleos dos cérebros do modelo de vertebrados de vida curta Nothobranchius furzeri para aplicações a jusante, como sequenciamento de RNA de núcleo único ou ensaio de núcleo único para cromatina acessível à transposase com sequenciamento (ATAC-seq).
Estudar o envelhecimento cerebral na resolução de uma única célula em sistemas vertebrados continua a ser um desafio devido ao custo, tempo e restrições técnicas. Aqui, demonstramos um protocolo para gerar bibliotecas de sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq) a partir dos cérebros do peixe-turquesa africano Nothobranchius furzeri, de vertebrados de vida naturalmente curta. O killifish turquesa africano tem uma vida útil de 4-6 meses e pode ser alojado de forma rentável, reduzindo assim as barreiras de custo e tempo para estudar o envelhecimento cerebral dos vertebrados. No entanto, são necessários protocolos personalizados para isolar núcleos de qualidade suficiente para experimentos unicelulares a jusante do cérebro de peixes jovens e idosos. Aqui, demonstramos um protocolo empiricamente otimizado para o isolamento de núcleos de alta qualidade do cérebro de killifish turquesa africano adulto, um passo crítico na geração de bibliotecas ômicas de núcleos únicos de alta qualidade. Além disso, mostramos que as etapas para reduzir o RNA de fundo contaminante são importantes para distinguir claramente os tipos de células. Em resumo, este protocolo demonstra a viabilidade de estudar o envelhecimento cerebral em organismos modelo de vertebrados não tradicionais.
Compreender os mecanismos do envelhecimento cerebral dos vertebrados é fundamental para abordar doenças neurodegenerativas relacionadas à idade, como Alzheimer e demência1. O peixe-turquesa africano (Nothobranchus furzeri) é o vertebrado de vida mais curta que pode ser criado em cativeiro e, devido à sua curta vida útil e comprometimento cognitivo associado à idade, é um excelente modelo de envelhecimento cerebral 2,3,4,5. Recentemente, o advento de tecnologias “ômicas” de célula única, como RNA-seq de núcleos únicos (snRNA-seq) e ensaio de núcleos únicos para cromatina acessível à transposase com sequenciamento (snATAC-seq), permitiram aos pesquisadores interrogar o envelhecimento cerebral em uma resolução sem precedentes 6,7,8. Esses métodos dependem do isolamento de núcleos, uma vez que a recuperação de células cerebrais, como neurônios, é muitas vezes muito desafiadora para isolar 6,7,8,9,10. No entanto, a maioria dos protocolos de isolamento de núcleos publicados é otimizada para organismos modelo de mamíferos 11,12,13,14,15. Assim, como existe atualmente uma necessidade não atendida de isolar núcleos cerebrais no killifish como um novo organismo modelo em ascensão no campo da pesquisa sobre envelhecimento2, o objetivo deste protocolo é estabelecer um método para isolar núcleos de alta qualidade do tecido congelado do killifish cerebral.
Aqui, um fluxo de trabalho simplificado e robusto é estabelecido que usa materiais comumente disponíveis para isolar núcleos de alta qualidade de cérebros de killifish. Este protocolo foi modificado a partir de um protocolo de Genômica 10x para cérebros de camundongos para acomodar os cérebros com menor teor de mielina do killifish turquesa africano, a fragilidade do tecido congelado e a necessidade de reduzir o conteúdo de detritos ambientais para aplicações relacionadas ao sequenciamento16. De fato, protocolos previamente otimizados para tecido cerebral de mamíferos 17,18 levam a uma má qualidade dos núcleos (ou seja, sobrelise) e/ou alto teor de detritos quando usados em cérebros congelados de killifish, tornando-os inadequados para uso com snRNA-seq de acordo com as recomendações para RNA-seq de núcleos únicos usando microfluídica (Figura Suplementar 1).
Além do isolamento dos núcleos, demonstramos como avaliar a qualidade e o rendimento dos núcleos por microscopia e citometria de fluxo. Este artigo fornece exemplos de resultados ótimos e subótimos e discute a solução de problemas. Este protocolo foi projetado e otimizado para cérebros de killifish congelados, mas também pode ser usado sem grandes modificações em amostras de killifish recém-dissecadas. Os núcleos cerebrais de Killifish isolados usando este método foram otimizados para uso em RNA-seq de núcleo único (snRNA-seq) como uma aplicação a jusante, mas também devem ser passíveis de uso em snATAC-seq e ATAC-seq a granel.
O protocolo aqui apresentado pode ser usado para gerar de forma reprodutível núcleos de alta qualidade a partir de cérebros de killifish. Este protocolo teve que ser projetado especificamente para o cérebro killifish, pois os protocolos típicos de isolamento de núcleos cerebrais baseados em mamíferos aplicados a cérebros de killifish resultaram consistentemente em baixa qualidade dos núcleos em nossas mãos. Suspeitamos que isso se deva ao menor teor relativo de mielina do cérebro de killifish em comparação com seus homólogos mamíferos, que lisariam e se aglomerariam em resposta às condições adversas necessárias para a lise de células cerebrais de mamíferos. Este protocolo é um avanço nos campos de envelhecimento e killifish, pois facilita a exploração do envelhecimento cerebral no nível de célula única em um modelo de custo e tempo eficaz do envelhecimento cerebral de vertebrados.
Este protocolo é robusto para amostras frescas ou congeladas, embora se deva considerar as aplicações a jusante ao usar tecido fresco ou congelado. O tecido congelado é muitas vezes conveniente, pois pode ser coletado e armazenado por meses enquanto as amostras são coletadas. Essas amostras podem ser usadas com segurança para aplicações como snRNA-seq. No entanto, o congelamento de amostras pode perturbar a estrutura nuclear e, portanto, a capacidade de medir com precisão a paisagem da cromatina por ATAC-seq21. Assim, para aplicações a jusante, como ATAC-seq em massa ou snATAC-seq, recomenda-se o uso de cérebros recém-dissecados em vez de cérebros congelados. Além disso, como todas as etapas após a homogeneização cerebral podem ser realizadas em paralelo, esse protocolo é passível de executar várias amostras em um período de tempo razoável, limitando assim a degradação do RNA causada pela incubação prolongada no gelo.
Além disso, é imperativo preparar tampões frescos (dentro de horas) após a realização da extração de núcleos. Descobrimos que detergentes, bem como BSA, devem ser adicionados aos buffers imediatamente antes do início do protocolo. Tampões contendo apenas sais (PBS, NaCl, etc.) podem ser feitos como concentrados, esterilizados por filtro (0,22 μm) e armazenados indefinidamente à temperatura ambiente. As soluções-mãe de BSA podem ser preparadas, esterilizadas e armazenadas a 4 °C no prazo de dias após a extracção dos núcleos (se preparadas a partir de um pó), mas devem ser sempre adicionadas aos tampões utilizados no presente protocolo imediatamente antes de o efectuarem. No entanto, recomendamos a preparação de soluções BSA no dia do protocolo. Se estiver usando soluções BSA pré-fabricadas de terceiros, é aconselhável usar garrafas frescas e fechadas. O uso de BSA fresco geralmente leva a um menor teor de detritos nos preparativos dos núcleos.
Se amostras frescas ou congeladas são usadas como entrada, é importante avaliar a qualidade dos núcleos após o isolamento dos núcleos. Embora este protocolo seja projetado especificamente para evitar a sobrelise, esta é a causa mais comum de perda de qualidade dos núcleos. A sobrelise pode resultar de muito tempo gasto no tampão de lise, manuseio excessivamente áspero dos núcleos, como pipetagem excessiva com uma ponta de pipeta de furo padrão, ou uma quantidade excessiva de tempo gasto entre o isolamento dos núcleos e as aplicações a jusante (>1 h). Núcleos excessivamente sobrecarregados muitas vezes terão periferias nucleares danificadas, que vazam DNA e causam aglomeração (Figura 2B). Isso levará a um aumento do número de múltiplos e contribuirá com ácidos nucleicos de fundo que interferirão nas aplicações a jusante, especialmente o snRNA-seq. Ambas as qualidades podem ser avaliadas por microscopia após o isolamento dos núcleos. Se for observada aglomeração nuclear excessiva, recomendamos tentar encurtar a incubação da etapa de lise para reduzir a chance de sobrelise. Como um método alternativo para aumentar os singletos dos núcleos, a classificação celular assistida por fluorescência (FACS) pode ser usada para enriquecer os singlets a jusante deste protocolo. No entanto, observamos que, ao trabalhar com núcleos já frágeis de tecido congelado, o estresse de cisalhamento que ocorre durante a triagem pode levar ao aumento da ruptura nuclear e, portanto, ao aumento do RNA/DNA ambiente. Além disso, observamos que o tempo necessário para executar uma classificação de rendimento FACS para núcleos ao processar várias amostras exigiria que todas as amostras de núcleos permanecessem no gelo por horas, enquanto outras amostras estão sendo classificadas. Assim, o aumento dos tempos de espera ao processar várias amostras em paralelo com a abordagem FACS também poderia levar à redução geral da qualidade dos núcleos e aumentar o risco de degradação do RNA. Assim, se o FACS for desejado para uma taxa de duplicidade reduzida, recomendamos que o teor de detritos seja verificado novamente após a classificação do rendimento e que a possível qualidade reduzida do RNA seja levada em conta para aplicações de RNA-seq de célula única como uma ressalva potencial.
Uma estimativa precisa da contagem de núcleos e da proporção de singletos é essencial para quase todas as aplicações “ômicas” a jusante e é de extrema importância. Devido à capacidade de facilmente portar e contar núcleos por tamanho, a citometria de fluxo é o método mais preciso de contagem de núcleos que avaliamos. Alternativamente, pode-se quantificar núcleos usando contadores de células como o Contador de Células Automatizadas Countess 2 FL da Invitrogen ou o Contador de Células Automatizadas DeNovix CellDrop . Para notar, o Contador Automatizado de Células Countess 2 FL da Invitrogen e, em muito menor grau, o DeNovix, tendem a superestimar as contagens de núcleos contando detritos como núcleos, o que significa que o tamanho manual pode ser necessário. Além disso, o citômetro de fluxo permite avaliar facilmente a pureza dos núcleos. Pode-se discernir a proporção relativa de núcleos singlete versus múltiplo de uma maneira quantitativa que é difícil pela microscopia. Isso é vital para o snRNA-seq e o snATAC-seq, uma vez que esses protocolos sofrerão de um excedente de amostras múltiplas, que devem ser excluídas das análises a jusante. Além dos múltiplos, a proporção relativa de “detritos” (núcleos fragmentados, detritos celulares) pode ser quantificada por citometria de fluxo e deve ser relativamente baixa, uma vez que este material geralmente contém ácidos nucleicos contaminantes que podem contribuir com um sinal de fundo e corromper dados “ômicos” de núcleo único.
Tal como acontece com os protocolos de isolamento de núcleos descritos anteriormente, as proporções de tipos celulares no tecido original não podem ser recapituladas fielmente na preparação dos núcleos19 e, portanto, devem ser interpretadas com cautela. Para notar, como todos os teleósteos, o killifish turquesa africano tem eritrócitos nucleados, que também devem ser representados na preparação dos núcleos. Esses núcleos podem ser identificados nos conjuntos de dados snRNA-seq e snATAC-seq pela maior expressão/acessibilidade dos genes da hemoglobina e podem ser excluídos computacionalmente, se desejado.
The authors have nothing to disclose.
Alguns painéis foram gerados com BioRender.com. Este trabalho em nosso laboratório foi apoiado pela NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant to B.T., uma bolsa da Simons Foundation como parte da Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, uma bolsa piloto da Navigage Foundation e um prêmio da Família Hanson-Thorell para B.A.B.
0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
Hydrochloric Acid | Sigma-Alrdich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |