כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד גרעינים מהמוחות של מודל בעלי החוליות קצרי הימים Nothobranchius furzeri עבור יישומים במורד הזרם כגון ריצוף RNA בעל גרעין יחיד או בדיקת גרעין יחיד עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף (ATAC-seq).
חקר הזדקנות המוח ברזולוציה של תא בודד במערכות חולייתנים נותר מאתגר בשל עלות, זמן ואילוצים טכניים. כאן אנו מדגימים פרוטוקול ליצירת ספריות ריצוף RNA חד-גרעיניות (snRNA-seq) ממוחם של בעלי החוליות האפריקאים קצרי החיים באופן טבעי, Nothobranchius furzeri. לדגי הטורקיז האפריקאיים יש תוחלת חיים של 4-6 חודשים וניתן לשכן אותם בצורה חסכונית, ובכך להפחית את מחסומי העלות והזמן לחקר הזדקנות המוח של בעלי חוליות. עם זאת, יש צורך בפרוטוקולים מותאמים אישית כדי לבודד גרעינים באיכות מספקת לניסויים חד-תאיים במורד הזרם ממוחם של דגים צעירים ומבוגרים. כאן אנו מדגימים פרוטוקול מותאם אמפירית לבידוד גרעינים איכותיים ממוחם של דגי טורקיז אפריקאים בוגרים, שלב קריטי ביצירת ספריות גרעיניות בודדות באיכות גבוהה. יתר על כן, אנו מראים כי השלבים להפחתת RNA ברקע מזהם חשובים להבחנה ברורה בין סוגי תאים. לסיכום, פרוטוקול זה מדגים את ההיתכנות של חקר הזדקנות המוח באורגניזמים מודל לא מסורתיים של בעלי חוליות.
הבנת המנגנונים של הזדקנות המוח של בעלי חוליות היא קריטית לטיפול במחלות נוירודגנרטיביות הקשורות לגיל, כגון אלצהיימר ודמנציה1. דג הטורקיז האפריקאי (Nothobranchus furzeri) הוא בעל החוליות בעל החיים הקצרים ביותר שניתן לגדל בשבי, ובשל תוחלת החיים הקצרה שלו והפגיעה הקוגניטיבית הקשורה לגיל, זהו מודל מצוין להזדקנות המוח 2,3,4,5. לאחרונה, הופעתן של טכנולוגיות “אומיקה” חד-תאיות, כגון גרעין יחיד RNA-seq (snRNA-seq) ובדיקת גרעינים בודדים עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף (snATAC-seq), אפשרו לחוקרים לחקור את המוח המזדקן ברזולוציה חסרת תקדים 6,7,8. שיטות אלה מסתמכות על בידוד גרעינים, שכן ההתאוששות של תאי מוח כגון נוירונים היא לעתים קרובות מאתגרת מכדי לבודד 6,7,8,9,10. עם זאת, רוב פרוטוקולי בידוד הגרעינים שפורסמו מותאמים לאורגניזמי מודל של יונקים 11,12,13,14,15. לפיכך, מכיוון שקיים כיום צורך בלתי מסופק בבידוד גרעיני המוח בדגי הקילי כאורגניזם מודל חדש בתחום מחקר ההזדקנות2, מטרת פרוטוקול זה היא לבסס שיטה לבידוד גרעינים איכותיים מרקמת דגי מוח קפואים.
כאן נוצרת זרימת עבודה יעילה וחזקה המשתמשת בחומרים זמינים בדרך כלל כדי לבודד גרעינים באיכות גבוהה ממוחות של דגי קילין. פרוטוקול זה שונה מפרוטוקול 10x Genomics עבור מוחות עכברים כדי להתאים למוחות בעלי תכולת המיאלין הנמוכה יותר של דגי קילו טורקיז אפריקאים, לשבריריות של רקמות קפואות ולצורך להפחית את תכולת הפסולת הסביבתית עבור יישומים הקשורים לריצוף16. ואכן, פרוטוקולים שעברו אופטימיזציה בעבר עבור רקמת מוח של יונקים17,18 מובילים לאיכות גרעינים ירודה (כלומר, ל-overlysis) ו/או לתכולת פסולת גבוהה כאשר משתמשים בהם על מוחות קפואים של דגי קיילי, מה שהופך אותם ללא מתאימים לשימוש עם snRNA-seq בהתאם להמלצות לגרעין יחיד RNA-seq באמצעות מיקרופלואידיקה (איור משלים 1).
בנוסף לבידוד גרעינים, אנו מדגימים כיצד להעריך את איכות הגרעינים ותפוקתם על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריה של זרימה. מאמר זה מספק דוגמאות לתוצאות אופטימליות ולא אופטימליות ודן בפתרון בעיות. פרוטוקול זה תוכנן והותאם למוחות של דגי קילי קפואים, אך ניתן להשתמש בו גם ללא שינויים משמעותיים בדגימות של דגי קילי שזה עתה נותחו. גרעיני מוח של Killifish שבודדו בשיטה זו עברו אופטימיזציה לשימוש בגרעין יחיד RNA-seq (snRNA-seq) כיישום במורד הזרם, אך הם צריכים להיות מקובלים לשימוש גם ב-snATAC-seq וב-ATAC-SEQ בתפזורת.
הפרוטוקול המוצג כאן יכול לשמש לשחזור גרעינים באיכות גבוהה ממוחות של דגי קילין. פרוטוקול זה היה צריך להיות מתוכנן במיוחד עבור מוח הקילפיש, שכן פרוטוקולי בידוד גרעיני מוח טיפוסיים המבוססים על יונקים המיושמים על מוחות של דגי קילי הביאו באופן עקבי לאיכות גרעינים ירודה בידינו. אנו חושדים שהסיבה לכך היא תכולת המיאלין היחסית הנמוכה יותר במוחם של דגי הקילין בהשוואה לעמיתיהם היונקים, אשר יתכנסו ויתגבשו בתגובה לתנאים הקשים הנדרשים לתזה של תאי מוח של יונקים. פרוטוקול זה הוא התקדמות בתחום ההזדקנות ודגי הקילין מכיוון שהוא מאפשר לחקור את הזדקנות המוח ברמת התא הבודד במודל חסכוני וחסכוני בזמן של הזדקנות המוח של בעלי חוליות.
פרוטוקול זה עמיד בפני דגימות טריות או קפואות, אם כי יש לקחת בחשבון את היישומים במורד הזרם בעת שימוש ברקמה טרייה או קפואה. רקמה קפואה היא לעתים קרובות נוחה מכיוון שניתן לאסוף ולאחסן אותה במשך חודשים בזמן איסוף הדגימות. דגימות כאלה יכולות לשמש בבטחה עבור יישומים כגון snRNA-seq. עם זאת, הקפאת דגימות עלולה לשבש את מבנה הגרעין ובכך את היכולת למדוד במדויק את נוף הכרומטין על ידי ATAC-seq21. לכן, עבור יישומים במורד הזרם כגון ATAC-seq בתפזורת או snATAC-seq, מומלץ להשתמש במוחות שנותחו זה עתה במקום במוחות קפואים. בנוסף, מכיוון שכל השלבים לאחר הומוגניזציה של המוח יכולים להתבצע במקביל, פרוטוקול זה מקובל להפעלת דגימות מרובות במסגרת זמן סבירה, ובכך מגביל את השפלת ה- RNA הנגרמת על ידי דגירה ממושכת על קרח.
יתר על כן, חובה להכין מאגרים טריים (תוך שעות) מביצוע מיצוי גרעינים. מצאנו כי יש להוסיף חומרי ניקוי כמו גם BSA למאגרים מיד לפני תחילת הפרוטוקול. מאגרים המכילים מלחים בלבד (PBS, NaCl וכו’) עשויים להיות מיוצרים כתרכיזים, מסננים מעוקרים (0.22 מיקרומטר) ומאוחסנים ללא הגבלת זמן בטמפרטורת החדר. ניתן להכין, לעקר ולאחסן תמיסות BSA בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס תוך ימים ספורים ממיצוי הגרעינים (אם הוכנו מאבקה), אך יש להוסיף אותן תמיד למאגרים המשמשים בפרוטוקול זה מיד לפני ביצוע הפרוטוקול. עם זאת, אנו ממליצים להכין פתרונות BSA ביום הפרוטוקול. אם אתם משתמשים בפתרונות BSA מוכנים מראש של צד שלישי, מומלץ להשתמש בבקבוקים טריים שלא נפתחו. שימוש ב-BSA טרי מוביל בדרך כלל לתכולת פסולת נמוכה יותר במכיני גרעינים.
בין אם דגימות טריות או קפואות משמשות כקלט, חשוב להעריך את איכות הגרעינים לאחר בידוד הגרעינים. למרות שפרוטוקול זה תוכנן במיוחד כדי למנוע התמזגות יתר, זוהי הסיבה השכיחה ביותר לאובדן איכות גרעינים. יתר עלול לנבוע מזמן רב מדי במאגר התזה, מטיפול גס מדי בגרעינים כגון פיפטינג מוגזם עם קצה פיפטה נשא סטנדרטי, או מכמות זמן מופרזת בין בידוד גרעינים ליישומים במורד הזרם (>1 שעות). גרעינים מוגזמים לעיתים קרובות פוגעים בפריפריות גרעיניות, שדולפות דנ”א וגורמות לגושים (איור 2B). זה יוביל למספר מוגבר של הכפלות ויתרום חומצות גרעין ברקע שיפריעו ליישומים במורד הזרם, במיוחד snRNA-seq. ניתן להעריך את שתי התכונות על ידי מיקרוסקופיה לאחר בידוד גרעינים. אם נצפתה התגבשות גרעינית מוגזמת, אנו ממליצים לנסות לקצר את שלב הדגירה של הליזיס כדי להפחית את הסיכוי להתנשאות יתר. כשיטה חלופית להגדלת גרעינים סינגלטים, ניתן להשתמש במיון תאים בסיוע פלואורסצנציה (FACS) כדי להעשיר עבור סינגלטים במורד הזרם של פרוטוקול זה. עם זאת, נציין כי כאשר עובדים עם גרעינים שכבר שבירים מרקמה קפואה, לחץ הגזירה המתרחש במהלך המיון עלול להוביל לקרע גרעיני מוגבר ובכך לעלייה ב-RNA/DNA הסביבתי. בנוסף, נציין כי הזמן הנדרש להפעלת מיון תפוקה של FACS עבור גרעינים בעת עיבוד דגימות מרובות ידרוש מכל דגימות הגרעינים להישאר על הקרח במשך שעות, בעוד דגימות אחרות ממוינות. לפיכך, זמני המתנה ארוכים יותר בעת עיבוד דגימות מרובות במקביל לגישת FACS עשויים גם הם להוביל לירידה כללית באיכות הגרעינים ולהגביר את הסיכון להתפרקות RNA. לפיכך, אם FACS מעוניין בקצב כפול מופחת, אנו ממליצים לבדוק שוב את תכולת הפסולת לאחר מיון התפוקה, ולשקול ירידה אפשרית באיכות ה-RNA עבור יישומי RNA-seq של תא בודד כאזהרה פוטנציאלית.
הערכה מדויקת של ספירת גרעינים ושיעור סינגלט חיונית כמעט לכל יישומי ה”אומיקה” במורד הזרם, והיא בעלת חשיבות עליונה. בשל היכולת לשער ולספור גרעינים בקלות לפי גודל, ציטומטריה של זרימה היא השיטה המדויקת ביותר לספירת גרעינים שהערכנו. לחלופין, ניתן לכמת גרעינים באמצעות מוני תאים כגון מונה התאים האוטומטי Countess 2 FL של Invitrogen או מונה התאים האוטומטי של DeNovix CellDrop. יש לציין כי מונה התאים האוטומטיים Countess 2 FL של Invitrogen, ובמידה פחותה בהרבה ה-DeNovix, נוטים להעריך יתר על המידה את ספירת הגרעינים על ידי ספירת פסולת כגרעינים, מה שאומר שייתכן שיהיה צורך בגודל ידני. יתר על כן, ציטומטר הזרימה מאפשר להעריך בקלות את טוהר הגרעינים. ניתן להבחין ביחס היחסי של גרעינים סינגלט לעומת גרעינים מרובים באופן כמותי שקשה על ידי מיקרוסקופיה. זה חיוני עבור snRNA-seq ו- snATAC-seq, שכן פרוטוקולים אלה יסבלו מעודף של דגימות מרובות, אשר יש להוציא מניתוחים במורד הזרם. בנוסף למכפלות, ניתן לכמת את החלק היחסי של “פסולת” (גרעינים מקוטעים, פסולת תאית) על ידי ציטומטריה של זרימה וחייב להיות נמוך יחסית, שכן חומר זה מכיל לעתים קרובות חומצות גרעין מזהמות שיכולות לתרום אות רקע ולהשחית נתוני “אומיקה” של גרעין יחיד.
בדומה לפרוטוקולי בידוד גרעינים שתוארו קודם לכן, לא ניתן לשחזר את הפרופורציות של סוגי התאים ברקמה המקורית בנאמנות בהכנה לגרעינים19, ולכן יש לפרש אותם בזהירות. כדי לציין, כמו כל הטלאוסטים, לדגי הטורקיז האפריקאים יש אריתרוציטים בעלי גרעינים, שגם הם צפויים להיות מיוצגים בהכנת הגרעינים. ניתן לזהות גרעינים אלה בערכות נתונים של snRNA-seq ו-snATAC-seq על ידי ביטוי/נגישות גבוהה יותר של גנים של המוגלובין, וניתן לשלול אותם באופן חישובי אם רוצים.
The authors have nothing to disclose.
כמה לוחות נוצרו עם BioRender.com. עבודה זו במעבדה שלנו נתמכה על ידי מענק ההכשרה לפוסט-דוקטורט של NIA T32 AG052374 ל-B.T., מענק מקרן סימונס כחלק משיתוף הפעולה של סימונס למען פלסטיות במוח המזדקן, מענק פיילוט מקרן Navigage ופרס משפחת הנסון-ת’ורל ל-B.A.B.
0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
Hydrochloric Acid | Sigma-Alrdich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |