Здесь мы представляем протокол для выделения ядер из мозга короткоживущей модели позвоночных Nothobranchius furzeri для последующих применений, таких как секвенирование одноядерной РНК или одноядерный анализ для транспозазно-доступного хроматина с секвенированием (ATAC-seq).
Изучение старения мозга при одноклеточном разрешении в системах позвоночных остается сложной задачей из-за стоимости, времени и технических ограничений. Здесь мы демонстрируем протокол для генерации одноядерных библиотек секвенирования РНК (snRNA-seq) из мозга естественно недолговечных африканских бирюзовых рыб-убийц Nothobranchius furzeri. Африканская бирюзовая киллифиш имеет продолжительность жизни 4-6 месяцев и может быть размещена экономически эффективным образом, что снижает затраты и временные барьеры для изучения старения мозга позвоночных. Тем не менее, необходимы индивидуальные протоколы для выделения ядер достаточного качества для последующих одноклеточных экспериментов из мозга молодых и пожилых рыб. Здесь мы демонстрируем эмпирически оптимизированный протокол для выделения высококачественных ядер из мозга взрослых африканских бирюзовых киллифишей, что является критическим шагом в создании высококачественных одноядерных омических библиотек. Кроме того, мы показываем, что шаги по снижению загрязняющей фоновой РНК важны для четкого разграничения типов клеток. Таким образом, этот протокол демонстрирует целесообразность изучения старения мозга у нетрадиционных модельных организмов позвоночных.
Понимание механизмов старения мозга позвоночных имеет решающее значение для решения возрастных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и деменция1. Африканская бирюзовая киллифиш (Nothobranchus furzeri) является самым короткоживущим позвоночным, которое можно разводить в неволе, и из-за его короткой продолжительности жизни и возрастных когнитивных нарушений, это отличная модель старения мозга 2,3,4,5. В последнее время появление одноклеточных «омических» технологий, таких как одиночные ядра RNA-seq (snRNA-seq) и анализ одноядер для транспозазно-доступного хроматина с секвенированием (snATAC-seq), позволили исследователям опрашивать стареющий мозг с беспрецедентным разрешением 6,7,8. Эти методы основаны на выделении ядер, поскольку восстановление клеток мозга, таких как нейроны, часто слишком сложно выделить 6,7,8,9,10. Однако большинство опубликованных протоколов выделения ядер оптимизированы для модельных организмов млекопитающих 11,12,13,14,15. Таким образом, поскольку в настоящее время существует неудовлетворенная потребность в выделении ядер мозга у киллифиша в качестве перспективного нового модельного организма в области исследований старения2, целью этого протокола является создание метода выделения высококачественных ядер из замороженной ткани киллифиша мозга.
Здесь установлен оптимизированный и надежный рабочий процесс, который использует общедоступные материалы для выделения высококачественных ядер из мозга киллифиша. Этот протокол был модифицирован из 10-кратного протокола геномики для мозга мыши, чтобы приспособиться к более низкому содержанию миелина в мозге африканской бирюзовой киллифиш, хрупкости замороженной ткани и необходимости снижения содержания мусора в окружающей среде для приложений, связанных с секвенированием16. Действительно, ранее оптимизированные протоколы длямозговой ткани млекопитающих 17,18 приводят к плохому качеству ядер (т.е. чрезмерному анализу) и/или высокому содержанию мусора при использовании на замороженном мозге киллифиш, что делает их непригодными для использования с snRNA-seq в соответствии с рекомендациями по одноядерным РНК-seq с использованием микрофлюидики (дополнительный рисунок 1).
В дополнение к выделению ядер мы демонстрируем, как оценивать качество и выход ядер с помощью микроскопии и проточной цитометрии. В этой статье приведены примеры как оптимальных, так и неоптимальных результатов, а также обсуждаются способы устранения неполадок. Этот протокол был разработан и оптимизирован для замороженного мозга киллифиша, но также может использоваться без серьезных модификаций на свежерассеченных образцах киллифиш. Ядра мозга Killifish, выделенные с помощью этого метода, были оптимизированы для использования в одноядренном RNA-seq (snRNA-seq) в качестве последующего приложения, но также должны поддаваться использованию в snATAC-seq и объемном ATAC-seq.
Представленный здесь протокол может быть использован для воспроизводимого генерирования высококачественных ядер из мозга киллифиша. Этот протокол должен был быть специально разработан для мозга киллифиша, поскольку типичные протоколы изоляции ядер мозга млекопитающих, применяемые к мозгу киллифиш, последовательно приводили к ухудшению качества ядер в наших руках. Мы подозреваем, что это связано с более низким относительным содержанием миелина в мозге киллифиша по сравнению с их коллегами-млекопитающими, которые будут лизироваться и сгущаться в ответ на суровые условия, необходимые для лизиса клеток мозга млекопитающих. Этот протокол является прогрессом в области старения и киллифиша, поскольку он облегчает исследование старения мозга на уровне одной клетки в дорогостоящей и эффективной по времени модели старения мозга позвоночных.
Этот протокол надежен для свежих или замороженных образцов, хотя при использовании свежей или замороженной ткани необходимо учитывать последующие применения. Замороженная ткань часто удобна, так как ее можно собирать и хранить в течение нескольких месяцев, пока собираются образцы. Такие образцы могут быть безопасно использованы для таких применений, как snRNA-seq. Однако замораживание образцов может нарушить ядерную структуру и, следовательно, способность точно измерять ландшафт хроматина с помощью ATAC-seq21. Таким образом, для последующих применений, таких как объемный ATAC-seq или snATAC-seq, рекомендуется использовать свежерассеченный мозг вместо замороженного мозга. Кроме того, поскольку все этапы после гомогенизации мозга могут выполняться параллельно, этот протокол поддается запуску нескольких образцов в разумные сроки, тем самым ограничивая деградацию РНК, вызванную длительной инкубацией на льду.
Кроме того, необходимо подготовить буферы, свежие (в течение нескольких часов) после извлечения ядер. Мы обнаружили, что моющие средства, а также BSA должны быть добавлены в буферы непосредственно перед началом протокола. Буферы, содержащие только соли (PBS, NaCl и т.д.), могут быть изготовлены в виде концентратов, стерилизованы фильтром (0,22 мкм) и храниться неопределенно долго при комнатной температуре. Растворы BSA могут быть приготовлены, стерилизованы и сохранены при 4°C в течение нескольких дней после экстракции ядер (если они приготовлены из порошка), но всегда должны быть добавлены к буферам, используемым в настоящем протоколе, непосредственно перед выполнением протокола. Тем не менее, мы рекомендуем готовить растворы BSA в день протокола. При использовании готовых растворов BSA от третьей стороны рекомендуется использовать свежие, неоткрытые бутылки. Использование свежего BSA обычно приводит к снижению содержания мусора в ядрах препов.
Независимо от того, используются ли свежие или замороженные образцы в качестве входных данных, важно оценить качество ядер после выделения ядер. Хотя этот протокол специально разработан, чтобы избежать чрезмерного анализа, это наиболее распространенная причина потери качества ядер. Чрезмерный анализ может быть результатом слишком большого количества времени, проведенного в буфере лизиса, чрезмерно грубого обращения с ядрами, такого как чрезмерное пипетирование стандартным наконечником пипетки, или чрезмерного количества времени, затрачиваемого между выделением ядер и последующим применением (>1 ч). Чрезмерно разрозненные ядра часто имеют поврежденные ядерные периферии, которые просачиваются в ДНК и вызывают слипание (рисунок 2B). Это приведет к увеличению числа мультиплетов и внесет фоновые нуклеиновые кислоты, которые будут мешать последующим приложениям, особенно snRNA-seq. Оба качества могут быть оценены с помощью микроскопии после выделения ядер. Если наблюдается чрезмерное слипание ядер, мы рекомендуем попытаться сократить инкубацию стадии лизиса, чтобы уменьшить вероятность чрезмерного лизиса. В качестве альтернативного метода увеличения синглетов ядер флуоресцентная сортировка клеток (FACS) может быть использована для обогащения синглетов ниже по этому протоколу. Однако мы отмечаем, что при работе с уже хрупкими ядрами из замороженной ткани напряжение сдвига, возникающее во время сортировки, может привести к увеличению ядерного разрыва и, следовательно, к увеличению окружающей РНК/ДНК. Кроме того, мы отмечаем, что время, необходимое для проведения сортировки выходов FACS для ядер при обработке нескольких образцов, потребует, чтобы все образцы ядер оставались на льду в течение нескольких часов, в то время как другие образцы сортируются. Таким образом, увеличение времени ожидания при обработке нескольких образцов параллельно с подходом FACS также может привести к общему снижению качества ядер и увеличению риска деградации РНК. Таким образом, если FACS желателен для снижения скорости дублетирования, мы рекомендуем, чтобы содержание мусора было проверено еще раз после сортировки выхода и чтобы возможное снижение качества РНК было принято во внимание для одноклеточных применений РНК-seq в качестве потенциального предостережения.
Точная оценка количества ядер и солидетной пропорции имеет важное значение почти для всех последующих применений «омики» и имеет первостепенное значение. Благодаря способности легко засекречивать и подсчитывать ядра по размеру, проточная цитометрия является наиболее точным методом подсчета ядер, который мы оценили. В качестве альтернативы можно количественно определить ядра с помощью клеточных счетчиков, таких как автоматизированный клеточный счетчик Countess 2 FL от Invitrogen или автоматизированный клеточный счетчик DeNovix CellDrop. Следует отметить, что автоматизированный счетчик клеток Графини 2 FL от Invitrogen и в гораздо меньшей степени DeNovix, как правило, переоценивают количество ядер, подсчитывая мусор как ядра, что означает, что может потребоваться ручное измерение размера. Кроме того, проточный цитометр позволяет легко оценить чистоту ядер. Можно различить относительную пропорцию синглетных и мультиплетных ядер количественным образом, что трудно с помощью микроскопии. Это жизненно важно для snRNA-seq и snATAC-seq, поскольку эти протоколы будут страдать от избытка мультиплетных образцов, которые должны быть исключены из последующих анализов. В дополнение к мультиплеттам, относительная доля «мусора» (фрагментированные ядра, клеточный мусор) может быть количественно определена с помощью проточной цитометрии и должна быть относительно низкой, поскольку этот материал часто содержит загрязняющие нуклеиновые кислоты, которые могут способствовать фоновому сигналу и повреждать данные «омиков» одного ядра.
Как и в случае с ранее описанными протоколами выделения ядер, пропорции типов клеток в исходной ткани не могут быть точно повторены в ядрах prep19 и, следовательно, должны интерпретироваться с осторожностью. Отметим, что, как и все телеосты, африканские бирюзовые киллифиши имеют ядра эритроцитов, которые, как ожидается, также будут представлены в ядрах преп. Эти ядра могут быть идентифицированы в наборах данных snRNA-seq и snATAC-seq по более высокой экспрессии/доступности генов гемоглобина и при желании могут быть исключены вычислительно.
The authors have nothing to disclose.
Некоторые панели были сгенерированы с BioRender.com. Эта работа в нашей лаборатории была поддержана грантом NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant to B.T., грантом от Simons Foundation в рамках Сотрудничества Саймонса по пластичности в стареющем мозге, пилотным грантом от Navigage Foundation и премией семьи Хэнсон-Торелл B.A.B.
0.4% Trypan Blue solution | Gibco | 15250061 | |
10x PBS | Bioland | PBS01-03 | |
15 mL Conicle Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | |
2 mL Tissue Grinder | Kimble | 885300-0002 | Dounce Homogenizer |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352054 | |
5M Sodium Chloride, Molecular Biology Grade | Promega | V4221 | |
autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | This corresponds to 1x PBS pH 7.2, 2 mM EDTA (used for flow cytometry) |
Debris Removal Solution | Miltenyi Biotec | 130-109-398 | |
DNA LoBInd Tube | Eppendorf | 22431021 | |
Echo Revolve microscope (fitted with 60x objective) | Echo | NA | No catalog number; Used to visually inspect nuclei. |
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL | Falcon | 352052 | FACS tube |
FLOWMI Cell Strainers, 40 μM | SP Bel-Art | 136800040 | Referred to as on-tip filters in Protocol |
Hydrochloric Acid | Sigma-Alrdich | 258146-500 mL | Used to lower TRIS pH from 8.0 to 7.4 |
Leica EZ4 dissecting scope | Leica | NA | No catalog number |
MACS BSA stock solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
MACS SmartStrainers (70 μM) | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer | Miltenyi Biotec | NA | No catalog number |
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade (Powder) | Millipore | 442611 | |
Megafuge 16R Centrifuge | ThermoScientific | 75003629 | |
Micro Cover Glass | VWR | 48393081 | |
Micro Slides Superfrost Plus | VWR | 48311-703 | |
Nonidet P-40 Substitute | Roche | (Roche) 11332473001/ Catalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich) | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | ThermoFisher | 85124 | |
Nuclease-Free HyPure Molecular Biology Grade Water | HyClone | SH30538.02 | |
NxGen RNase Inhibitor (50,000 U) | Lucigen | 30281-2 | |
Propidium Iodide solution | MBL | FP00010020 | |
PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye | Biorad | 1351303 | |
TipOne RPT Pipette Tips (Ultra low retention, filtered) in 10 µL, 20 µL, 200 µL, and 1000 µL sizes | USA Scientific | #1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830 | |
Tricaine-S (MS 222) | Syndel | Tricaine10G | Syndel is an FDA-approved provider for pharmaceutical grade Tricaine |
TRIS, 1 M, pH 8.0 | VWR | E199-500 mL | |
Wide Bore Pipet Tips | Axygen | T-1005-WB-C |