Aqui apresentamos um protocolo para a obtenção de fatias de tronco cerebral auditiva não coronal do embrião de frango para a investigação de propriedades tonotópicas e trajetórias de desenvolvimento dentro de uma fatia de tronco cerebral. Essas fatias incluem seções sagita, horizontal e horizontal/transversal que abrangem regiões tonotópicas maiores dentro de um plano de fatia individual que as seções coronais tradicionais.
O embrião de frango é um modelo animal amplamente aceito para estudar o brainstem auditivo, composto por microcircuito altamente especializado e topologia neuronal orientada diferencialmente ao longo de um eixo tonotópico (ou seja, frequência). O eixo tonotópico permite a codificação segregada de sons de alta frequência no plano rostral-medial e codificação de baixa frequência em regiões caudo-laterais. Tradicionalmente, as fatias de tronco cerebral coronal de tecido embrionário permitem o estudo de lamina de iso-frequência individual relativa. Embora suficiente para investigar questões anatômicas e fisiológicas relativas a regiões individuais de iso-frequência, o estudo da variação tonotópica e seu desenvolvimento em áreas maiores auditivas do tronco cerebral é um pouco limitado. Este protocolo relata técnicas de corte cerebral de embriões de frango que englobam gradientes maiores de regiões de frequência no tronco cerebral auditivo inferior. A utilização de diferentes métodos de corte para tecido cerebral auditivo de frango permite experimentos eletrofisiológicos e anatômicos dentro de uma fatia do tronco cerebral, onde gradientes maiores de propriedades tonotópicas e trajetórias de desenvolvimento são melhor preservados do que seções coronais. Múltiplas técnicas de corte permitem uma melhor investigação das diversas propriedades anatômicas, biofísicas e tonotópicas dos microcircuitos do tronco cerebral auditivo.
O embrião de frango é um modelo de pesquisa valioso para estudar questões biológicas básicas em inúmeras e diversas áreas científicas, incluindo biologia celular, imunologia, patologia e neurobiologia do desenvolvimento. O microcircuito do brainstem auditivo de frango é um excelente exemplo de um circuito altamente especializado que pode ser entendido em termos de morfologia auditiva e fisiologia. Por exemplo, Rubel e Parks (1975) descreveram pela primeira vez a orientação tonotópica (ou seja, gradiente de frequência) do núcleo de frango magnocelularis (NM) e núcleo laminaris (NL) como uma função linear através do eixo dos núcleos, orientada ~30° em relação ao plano sagital. Neurônios individuais em NM e NL codificam sua melhor frequência sonora conhecida como sua frequência característica (CF)-ao longo do plano rostral-medial para a região caudo-lateral. Neurônios sensíveis à alta frequência estão na região rostral-medial e neurônios sensíveis à baixa frequência estão localizados de forma lateral. Como tal, os métodos tradicionais de dissecção do tecido cerebral auditivo para estudar propriedades tonotópicas têm utilizado sucessivas fatias coronais. De fato, microcircuitos auditivos de embriões de frango em desenvolvimento foram estabelecidos como um sistema modelo para o estudo do processamento de sinais de funções auditivas tonotópicas através de sucessivas fatias de tronco cerebral coronal caudal-to-rostral por décadas 1,2,3,4,5,6.
No entanto, a organização tonotópica de NM e NL é topologicamente e morfologicamente complicada. As entradas nervosas auditivas são distribuídas de tal forma que as entradas de CF altas terminam em estruturas semelhantes a pontas que cobrem pelo menos um quarto da circunferência somática de uma célula de NM adendritic. Por outro lado, as entradas de CF baixas não são organizadas com terminais finais semelhantes a lâmpadas, mas com múltiplas sinapses bouton em dendritos de neurônios NM. As entradas de CF médio terminam como lâmpada final e sinapses semelhantes a bouton 4,7,8,9,10,11,12. Em NL, o gradiente dendrótico altamente estereotipado é evidente não apenas no comprimento dendrático, mas também na largura dendrítica. Este gradiente dendrótico único está intimamente de acordo com o eixo tonotópico. Os dendritos sofrem um aumento de 11 vezes no comprimento e aumento de cinco vezes na largura de neurônios de alta a baixa CF, respectivamente6. Para superar tais distribuições complicadas desses núcleos em fatias coronais, este protocolo descreve abordagens de dissecção nos planos sagitos, horizontais e horizontais/transversais. Essas técnicas de corte fornecem exemplos de tecido cerebral auditivo que exibem propriedades tonotópicas máximas em um plano de fatia individual.
Seções coronais de tecido cerebral embrionário de frango permitiram o estudo de lamina iso-freqüência individual relativa por décadas 1,2,5. No entanto, a organização tonotópica (ou seja, frequência) do tronco auditivo da galinha é topologicamente complicada e pode ser mais acessível em outros eixos anatômicos, dependendo da questão específica da pesquisa. Embora suficiente para investigar questões anatômicas e fisiológicas relativas a regiões individuais de isoquência, o estudo de variações tonotópicas e seu desenvolvimento em áreas maiores do tronco cerebral auditivo são um pouco limitados por seções coronais. Para superar essa limitação, este protocolo descreve abordagens nos planos sagital, horizontal e horizontal/transverso para fornecer exemplos adicionais de tecido cerebral auditivo que exibem propriedades tonotópicas máximas e gradientes em uma seção individual do tronco cerebral.
Seções sagilas de regiões auditivas do tronco cerebral mostram que diferentes áreas tonotópicas estão distribuídas em uma região maior dentro da fatia em comparação com seções coronais (área auditiva sagital = ~300-600 μm, área auditiva coronal = ~200-350 μm). Por exemplo, as regiões NM e NL foram visualizadas sobre uma área maior ao longo do eixo rostro-caudal em seções sagitárias (por exemplo, Figura 2B), e o gradiente tonotópico funcional que corre ao longo deste eixo anatômico foi em grande parte contido dentro de uma única fatia sagital. Isso foi confirmado ainda com registros atuais de diferenças neuronais intrínsecas que variam ao longo do gradiente rostral-caudal como relatado anteriormente14,15 (por exemplo, Figura 3C,D). Experimentos futuros que destacam propriedades anatômicas e imunohistoquímicas ao longo do eixo tonotópico poderiam investigar ainda mais gradientes conhecidos de propriedades auditivas dentro de um único plano de fatia sagital. Estes incluem, mas não se limitam a, padrões de coloração map2 e padrões de expressão de canais de potássio, que são gradientes conhecidos de arquitetura dendrítica e propriedades intrínsecas de NM e NL que foram previamente mostrados em sucessivas seções coronais16.
Seções horizontais de regiões auditivas do tronco cerebral mostram que o NM e o NL estão localizados em direção à linha média. Uma porção de fibras axonais auditivas corre diagonalmente ou perpendicularmente ao plano horizontal (Figura 4). Estas fibras podem ser seguidas fazendo uma fatia angular aguda de 45° para o plano sagital. As fatias horizontais/transversais resultantes foram maiores que as fatias sagiais ou horizontais, e fibras longas axonascidas perdulicadas através do eixo rostro-caudal para ambos os lados ipsilaterais e contralaterais. Tanto nm quanto NL podem ser visualizados em uma região diagonal maior (~400-700 μm) de modo que as conexões contralaterais possam ser visualizadas ao longo de um eixo lateral-medial. Além disso, o plano de fatia horizontal/transversal também mostra como as regiões auditivas e o gradiente tonotópico resultante fazem uma curva angular (Figura 5). A exposição angular de conexões contralaterais em uma área maior torna essas fatias mais adequadas para estimulação eletrofisiológica e estudos microcircuários do que as tradicionais fatias coronais.
Vantagens adicionais
A formação de microcircuitos auditivos requer coordenação espostetemporal de pistas que promovam a sobrevivência neuronal, a sinápgeno, a diferenciação axonal, a arquitetura dendrítica e o amadurecimento. Assim, uma seção alternativa do cérebro do microcircuito auditivo do embrião de frango pode ser usada para os seguintes tópicos de pesquisa: organização morfológica de neurônios em dimensões topograficamente diferentes; organização e mapeamento dos conectomes de todos os núcleos auditivos e vestibulares; identificação e caracterização dos padrões de atividade dos constituintes do circuito em planos iso-freqüência e tonotópicos; a organização topográfica de microcircuitos excitatórios versus inibitórios e relações com populações especializadas de neurônios (núcleos); localização espacial dos neurônios dos núcleos auditivos e sua CF17 preditiva; segmentação sistemática de tipos neuronais tonotópicos específicos; rastreamento de células progenitoras e seu desenvolvimento em núcleos conservados; linhagem genética das células à evolução dos circuitos neuronais18; anatomia do tronco cerebral comparativo entre espécies; investigação de circuitos vestibulares como o complexo vestibular de Deiter (DC)19; e sincronia e conversa cruzada entre núcleos vestibulares.
Uma abordagem multifacetada usando diferentes planos de fatias pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre propriedades anatômicas e biofísicas desconhecidas de microcircuitos do tronco cerebral. Um bom exemplo é a relação entre os principais núcleos auditivos (NM, NA, NL e SON) e os núcleos vestibulares, incluindo o núcleo dorsal do lemniscus lateral (LLDp), o núcleo semilunar (SLu)20 e o núcleo tangencial (TN)3. No entanto, este protocolo e esses estudos baseados em fatias têm algumas limitações.
Precauções e limitações
Dependendo da instituição que realiza os experimentos, as diretrizes éticas e o manuseio de embriões de frango podem diferir. Enquanto os Institutos Nacionais de Diretrizes de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório permitem a decapitação rápida, existem métodos alternativos para a eutanásia de embrião de frango21. O tecido cerebral de embrião de frango é macio e delicado comparado com embriões mais antigos. Tem várias conexões e vasos sanguíneos na superfície que precisam de cuidado extra ao removê-los. O tecido deve ser mantido em dACSF gelado e perfumado com 95% de O2/5% de CO2 para aumentar a viabilidade.
O método de corte sagital só é útil para tonotopy ipsilateral. Este método de corte fornece fatias maiores do que fatias coronais, o manuseio pode ser precário. No entanto, pode-se cortar as fatias usando métodos de agulha cruzada descritos em detalhes em outros lugares22. O uso de 4% de LMP agarose block embedded brainstem pode salvar estruturas delicadas em fatias, mas deve-se tomar cuidado para não derramar agarose excessivamente quente. Defini-lo rapidamente colocando o tronco cerebral bloqueado por agarose em um ambiente refrigerado por ~1 min torna as fatias mais viáveis para gravações eletrofisiológicas.
A aplicação de supercola em quantidades em excesso pode ser tóxica. Deve ser aplicado minimamente, e os valores excedentes devem ser lavados imediatamente alterando o dACSF. Para fatias angulares agudas (45°), cortar o ângulo do bloco de agarose é fundamental; pode-se usar um espelho para ver o ângulo frontal enquanto corta o bloco de agarose com uma lâmina afiada. As lâminas disponíveis comercialmente podem ter um revestimento de cera que deve ser limpo com álcool e seco antes do uso. A otimização é necessária para a velocidade e frequência de corte de vibratome, pois tufos de fibra axonal são mais difíceis do que tecido cortical ou matricial. Manter uma alta amplitude e usar a solução de dissecção refrigerada pode evitar danos teciduais.
Todas as soluções devem ser preparadas frescas, e Ca2+ e Mg2+ devem ser adicionados ao ACSF depois de borbulhar 95% O2/5% CO2 . Caso contrário, pode haver precipitação de Ca2+. Um pincel deve ser usado para manusear as fatias suavemente dentro do vibratome. Mantenha o tempo total de corte abaixo de 15 minutos, se possível. Uma pipeta pasteur de vidro pode ser usada para manobrar fatias de tronco cerebral.
Não utilize detergentes ou agentes de lavagem corrosivos para vidros e equipamentos que entrem em contato com as fatias utilizadas na eletrofisiologia. As imagens tiradas representam o aparecimento de tecido de 200-300 μM de espessura sob a óptica de contraste de interferência diferencial (DIC). A qualidade visual será mais pobre do que a imunohistoquímica ou microscopia eletrônica, mas reflete com precisão o que um experimentador verá ao realizar gravações eletrofisiológicas.
Estudos relativos ao desenvolvimento precoce de microcircuitos ao longo de um eixo anatômico alternativo, sejam eles dorsais-ventral, rostral-caudal ou ipsilateral-contralateral, são limitados no tronco auditivo da galinha. Uma das razões para isso é porque o papel dos códigos transcricionais e da regulação do desenvolvimento tonotópico no tronco cerebral ainda não é totalmente compreendido. Fenômenos funcionais como modulação de cima para baixo e atividade espontânea são muitas vezes perdidos ao observar a atividade in vitro. No entanto, a pesquisa in vivo é complementada por gravações específicas e diretas de neurônios únicos somente possíveis nessas condições de fatia. O refinamento da obtenção de tecido cerebral ao longo de diferentes orientações poderia fornecer informações perspicazes sobre o desenvolvimento e a complexidade dos gradientes tonotópicos no microcircuito do tronco cerebral auditivo da galinha.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é suportado pela subvenção NIH/NIDCD R01 DC017167. Agradecemos a Kristine McLellan por fornecer comentários editoriais sobre uma versão anterior do manuscrito.
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