Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Gewinnung nicht-koronaler auditorischer Hirnstammschnitte des Hühnerembryos zur Untersuchung von tonotopischen Eigenschaften und Entwicklungsverläufen innerhalb einer Hirnstammscheibe. Diese Schnitte umfassen sagittale, horizontale und horizontale / transversale Abschnitte, die größere tonotopische Regionen innerhalb einer einzelnen Schichtebene umfassen als die traditionellen koronalen Abschnitte.
Der Hühnerembryo ist ein weithin akzeptiertes Tiermodell zur Untersuchung des auditorischen Hirnstamms, bestehend aus hochspezialisierten Mikroschaltkreisen und neuronaler Topologie, die differentiell entlang einer tonotopen (dh Frequenz) Achse orientiert sind. Die tonotopische Achse erlaubt die segregierte Kodierung von hochfrequenten Klängen in der rostral-medialen Ebene und niederfrequenter Kodierung in caudo-lateralen Regionen. Traditionell erlauben koronale Hirnstammschnitte von embryonalem Gewebe die Untersuchung relativer individueller iso-Frequenzlamina. Obwohl ausreichend, um anatomische und physiologische Fragen in Bezug auf einzelne iso-Frequenzregionen zu untersuchen, ist die Untersuchung der tonotopischen Variation und ihrer Entwicklung über größere auditorische Hirnstammbereiche hinweg etwas begrenzt. Dieses Protokoll berichtet über Hirnstammschnitttechniken aus Hühnerembryonen, die größere Gradienten von Frequenzbereichen im unteren auditorischen Hirnstamm umfassen. Die Verwendung verschiedener Schnittmethoden für Hühner-Hirnstammgewebe ermöglicht elektrophysiologische und anatomische Experimente innerhalb einer Hirnstammscheibe, bei denen größere Gradienten von tonotopischen Eigenschaften und Entwicklungsverläufen besser erhalten sind als koronale Abschnitte. Mehrere Slicing-Techniken ermöglichen eine verbesserte Untersuchung der vielfältigen anatomischen, biophysikalischen und tonotopischen Eigenschaften von auditorischen Hirnstamm-Mikroschaltkreisen.
Der Hühnerembryo ist ein wertvolles Forschungsmodell, um grundlegende biologische Fragen in zahlreichen und vielfältigen wissenschaftlichen Bereichen wie Zellbiologie, Immunologie, Pathologie und Entwicklungsneurobiologie zu untersuchen. Die Mikroschaltung des Hörhirnstamms des Huhns ist ein hervorragendes Beispiel für einen hochspezialisierten Schaltkreis, der in Bezug auf die auditive Morphologie und Physiologie verstanden werden kann. Zum Beispiel beschrieben Rubel und Parks (1975) erstmals die tonotopische Orientierung (d.h. Frequenzgradient) des Hühnerkerns magnocellularis (NM) und des Nucleus laminaris (NL) als lineare Funktion über die Achse der Kerne, die ~30° in Bezug auf die sagittale Ebene orientiert ist. Einzelne Neuronen in NM und NL kodieren ihre beste Schallfrequenz – bekannt als ihre charakteristische Frequenz (CF) – entlang der rostral-medialen Ebene zur caudo-lateralen Region. Hochfrequente Neuronen befinden sich im rostral-medialen Bereich und niederfrequente Neuronen caudo-lateral. Daher haben traditionelle Dissektionsmethoden von auditorischem Hirnstammgewebe zur Untersuchung onotopischer Eigenschaften aufeinanderfolgende koronale Schnitte verwendet. Tatsächlich haben sich auditive Mikroschaltkreise von sich entwickelnden Hühnerembryonen als Modellsystem für die Untersuchung der Signalverarbeitung von tonotopischen Hörfunktionen durch aufeinanderfolgende kaudale bis rostrale koronale Hirnstammschnitte für Jahrzehnte etabliert 1,2,3,4,5,6.
Die tonotopische Organisation von NM und NL ist jedoch topologisch und morphologisch verworren. Hörnerveninputs sind so verteilt, dass hohe CF-Inputs in endbulbartigen Strukturen enden, die mindestens ein Viertel des somatischen Umfangs einer adendritischen NM-Zelle bedecken. Umgekehrt sind niedrige CF-Eingänge nicht mit glühbirnenartigen Endanschlüssen organisiert, sondern mit mehreren Boutonsynapsen auf Dendriten von NM-Neuronen. Mittlere CF-Eingänge enden sowohl als Endkolben als auch als Bouton-ähnliche Synapsen 4,7,8,9,10,11,12. In NL zeigt sich der stark stereotype dendritische Gradient nicht nur in der dendritischen Länge, sondern auch in der dendritischen Breite. Dieser einzigartige dendritische Gradient entspricht eng der tonotopischen Achse. Die Dendriten erfahren eine 11-fache Längen- und Fünffache Zunahme der Breite von High- zu Low-CF-Neuronen bzw.6. Um solche verworrenen Verteilungen dieser Kerne in koronalen Schnitten zu überwinden, beschreibt dieses Protokoll Dissektionsansätze in der sagittalen, horizontalen und horizontalen/transversalen Ebene. Diese Schnitttechniken liefern Beispiele für auditorisches Hirnstammgewebe, das maximale tonotopische Eigenschaften in einer einzelnen Schnittebene aufweist.
Koronale Abschnitte des embryonalen Hirnstammgewebes von Hühnern ermöglichen seit Jahrzehnten die Untersuchung relativer individueller Isofrequenzlamina 1,2,5. Die tonotope (dh Häufigkeit) Organisation des Hörhirnstamms des Hühners ist jedoch topologisch verworren und kann in anderen anatomischen Achsen je nach spezifischer Forschungsfrage leichter zugänglich sein. Obwohl dies ausreicht, um anatomische und physiologische Fragen in Bezug auf einzelne iso-Frequenzregionen zu untersuchen, sind die Untersuchung tonotopischer Variationen und ihre Entwicklung über größere auditorische Hirnstammbereiche hinweg durch koronale Abschnitte etwas eingeschränkt. Um diese Einschränkung zu überwinden, beschreibt dieses Protokoll Ansätze in der sagittalen, horizontalen und horizontalen / transversalen Ebene, um zusätzliche Beispiele für auditives Hirnstammgewebe zu liefern, das maximale tonotopische Eigenschaften und Gradienten in einem einzelnen Hirnstammabschnitt aufweist.
Sagittale Abschnitte von auditorischen Hirnstammregionen zeigen, dass verschiedene tonotopische Bereiche im Vergleich zu koronalen Abschnitten über eine größere Region innerhalb der Scheibe verteilt sind (sagittaler Hörbereich = ~300-600 μm, koronaler Hörbereich = ~200-350 μm). Zum Beispiel wurden NM- und NL-Regionen über einen größeren Bereich entlang der rostro-kaudalen Achse in sagittalen Abschnitten visualisiert (z. B. Abbildung 2B), und der funktionelle tonotopische Gradient, der entlang dieser anatomischen Achse verläuft, war weitgehend in einer einzigen sagittalen Scheibe enthalten. Dies wurde weiter durch Strom-Clamp-Aufnahmen von intrinsischen neuronalen Unterschieden bestätigt, die entlang des rostral-kaudalen Gradienten variieren, wie zuvor berichtet14,15 (z. B . Abbildung 3C,D). Zukünftige Experimente, die anatomische und immunhistochemische Eigenschaften entlang der tonotopischen Achse hervorheben, könnten bekannte Gradienten auditiver Eigenschaften innerhalb einer einzelnen sagittalen Schichtebene weiter untersuchen. Dazu gehören unter anderem MAP2-Färbungs- und Kaliumkanalexpressionsmuster, bei denen es sich um bekannte Gradienten der dendritischen Architektur und intrinsische Eigenschaften von NM und NL handelt, die zuvor in aufeinanderfolgenden koronalen Abschnitten gezeigt wurden16.
Horizontale Abschnitte von auditorischen Hirnstammregionen zeigen, dass NM und NL in Richtung Mittellinie liegen. Ein Teil der auditorischen axonalen Fasern verläuft diagonal oder senkrecht zur horizontalen Ebene (Abbildung 4). Diesen Fasern kann gefolgt werden, indem eine spitze Winkelscheibe 45° zur sagittalen Ebene gemacht wird. Die resultierenden horizontalen / transversalen Scheiben waren größer als die sagittalen oder horizontalen Scheiben, und lange axonale Fasern verliefen durch die rostro-kaudale Achse sowohl für ipsilaterale als auch für kontralaterale Seiten. Sowohl NM als auch NL können in einem größeren diagonalen Bereich (~400-700 μm) sichtbar gemacht werden, so dass kontralaterale Verbindungen entlang einer lateral-medialen Achse sichtbar gemacht werden können. Darüber hinaus zeigt die horizontale/transversale Schichtebene, wie die Gehörregionen und der resultierende tonotopische Gradient eine Winkelkurve machen (Abbildung 5). Durch die Winkelexposition kontralateraler Verbindungen in einem größeren Bereich eignen sich diese Schnitte besser für elektrophysiologische Stimulations- und Mikroschaltungsstudien als herkömmliche koronale Schnitte.
Weitere Vorteile
Die Bildung auditiver Mikroschaltkreise erfordert eine raumzeitliche Koordination von Hinweisen, die das neuronale Überleben, die Synaptogenese, die axonale Differenzierung, die dendritische Architektur und die Reifung fördern. So kann ein alternativer Hirnstammschnitt des Hörmikroschaltkreises des Hühnerembryos für folgende Forschungsthemen verwendet werden: morphologische Organisation von Neuronen in topographisch unterschiedlichen Dimensionen; Organisation und Kartierung der Konnektome aller auditorischen und vestibulären Kerne; Identifizierung und Charakterisierung der Aktivitätsmuster von Schaltungsbestandteilen in iso-Frequenz- und tonotopischen Ebenen; die topographische Organisation von exzitatorischen versus inhibitorischen Mikroschaltkreisen und Beziehungen zu spezialisierten Neuronenpopulationen (Kernen); räumliche Lokalisierung von Hörkernneuronen und ihre prädiktive CF17; systematisches Targeting spezifischer onotopischer neuronaler Typen; Verfolgung von Vorläuferzellen und ihrer Entwicklung zu konservierten Kernen; genetische Abstammung von Zellen zur Evolution neuronaler Schaltkreise18; vergleichende Hirnstammanatomie zwischen Arten; Untersuchung von vestibulären Schaltkreisen wie Deiters vestibulärem Komplex (DC)19; und Synchronie und Übersprechen zwischen vestibulären Kernen.
Ein facettenreicher Ansatz mit verschiedenen Schichtebenen kann helfen, grundlegende Fragen zu unbekannten anatomischen und biophysikalischen Eigenschaften von Hirnstamm-Mikroschaltkreisen zu beantworten. Ein gutes Beispiel ist die Beziehung zwischen den wichtigsten Hörkernen (NM, NA, NL und SON) und den vestibulären Kernen, einschließlich des dorsalen Kerns des lateralen Lemniscus (LLDp), des Halbmondkerns (SLu)20 und des Tangentialkerns (TN)3. Dieses Protokoll und diese Slice-basierten Studien haben jedoch einige Einschränkungen.
Vorsichtsmaßnahmen und Einschränkungen
Je nach Institution, die die Experimente durchführt, können sich die ethischen Richtlinien und der Umgang mit Hühnerembryonen unterscheiden. Während die National Institutes of Health Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals eine schnelle Enthauptung erlauben, gibt es alternative Methoden zur Euthanasie von Hühnerembryonen21. Früh entwickelndes Hirnstammgewebe des Hühnerembryos ist im Vergleich zu älteren Embryonen weich und empfindlich. Es hat mehrere Verbindungen und Blutgefäße auf der Oberfläche, die beim Entfernen besonders vorsichtig sind. Das Gewebe sollte in eiskaltem dACSF aufbewahrt und mit 95% O 2/5% CO2 perfundiert werden, um die Lebensfähigkeit zu erhöhen.
Die sagittale Schnittmethode ist nur für die ipsilaterale Tonotopie nützlich. Diese Schneidemethode liefert größere Scheiben als koronale Scheiben, deren Handhabung prekär sein könnte. Man kann die Scheiben jedoch mit Kreuznadelmethoden trimmen, die an anderer Stelle ausführlich beschriebensind 22. Die Verwendung von 4% LMP-Agaroseblock eingebetteter Hirnstamm kann empfindliche Strukturen in Scheiben retten, aber es muss darauf geachtet werden, dass keine übermäßig heiße Agarose gegossen wird. Das schnelle Einstellen durch Platzieren des agaroseblockierten Hirnstamms in einer gekühlten Umgebung für ~ 1 min macht Scheiben für elektrophysiologische Aufnahmen lebensfähiger.
Die Anwendung von Sekundenkleber in überschüssigen Mengen kann giftig sein. Es muss minimal aufgetragen werden, und überschüssige Mengen sollten sofort durch Wechseln des dACSF gewaschen werden. Bei spitzen Winkelscheiben (45°) ist das Schneiden des Winkels des Agaroseblocks entscheidend. Man kann einen Spiegel verwenden, um den vorderen Winkel zu sehen, während man den Agaroseblock mit einer scharfen Klinge schneidet. Handelsübliche Klingen können eine Wachsbeschichtung aufweisen, die vor Gebrauch mit Alkohol abgewischt und getrocknet werden sollte. Eine Optimierung ist für die Schnittgeschwindigkeit und -häufigkeit des Vibratoms erforderlich, da axonale Faserbüschel härter sind als kortikales oder Matrixgewebe. Die Beibehaltung einer hohen Amplitude und die Verwendung einer gekühlten Dissektionslösung können Gewebeschäden verhindern.
Alle Lösungen sollten frisch zubereitet werden, und Ca 2+ und Mg2+ sollten dem ACSF zugegeben werden, nachdem 95% O 2/5% CO2 gespritzt wurden. Andernfalls kann es zu Niederschlägen von Ca2+ kommen. Ein Pinsel sollte verwendet werden, um die Scheiben sanft innerhalb des Vibratoms zu behandeln. Halten Sie die gesamte Schneidezeit nach Möglichkeit unter 15 Minuten. Eine Pasteur-Pipette aus Glas kann verwendet werden, um Hirnstammscheiben zu manövrieren.
Verwenden Sie keine Reinigungsmittel oder ätzenden Waschmittel für Gläser und Geräte, die mit den in der Elektrophysiologie verwendeten Scheiben in Kontakt kommen. Die aufgenommenen Bilder zeigen das Aussehen von 200-300 μM dickem Gewebe unter Differential Interference Contrast (DIC) Optik. Die visuelle Qualität wird schlechter sein als die Immunhistochemie oder Elektronenmikroskopie, aber sie spiegelt genau wider, was ein Experimentator bei der Durchführung elektrophysiologischer Aufnahmen sehen wird.
Studien zur frühen Entwicklung von Mikroschaltkreisen entlang einer alternativen anatomischen Achse, sei es dorsal-ventral, rostral-kaudal oder ipsilateral-kontralateral, sind im Hörhirnstamm des Huhns begrenzt. Ein Grund dafür ist, dass die Rolle von Transkriptionscodes und die Regulation der tonotopischen Entwicklung im Hirnstamm noch nicht vollständig verstanden ist. Funktionelle Phänomene wie Top-Down-Modulation und spontane Aktivität gehen bei der Beobachtung der Aktivität in vitro oft verloren. Die In-vivo-Forschung wird jedoch durch spezifische und direkte Einzelneuronenaufnahmen ergänzt, die nur unter diesen Schnittbedingungen möglich sind. Die Verfeinerung der Gewinnung von Hirnstammgewebe entlang verschiedener Orientierungen könnte aufschlussreiche Informationen über die Entwicklung und Komplexität von tonotopischen Gradienten in den auditorischen Hirnstamm-Mikroschaltkreisen des Huhns liefern.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wird durch den NIH / NIDCD R01 DC017167 Zuschuss unterstützt. Wir danken Kristine McLellan für die redaktionellen Kommentare zu einer früheren Version des Manuskripts.
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