概要

במבחנה בדיקת סמים נגד כל שלבי מחזור החיים של טריפנוזומה קרוזי באמצעות טפילים המבטאים β-גלקטוזידאז

Published: November 05, 2021
doi:

概要

אנו מתארים בדיקה קולורימטרית בתפוקה גבוהה המודדת את פעילות β-גלקטוזידאז בשלושה שלבי מחזור חיים של טריפנוזומה קרוזי, הגורם הסיבתי של מחלת צ’אגאס. ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לזהות תרכובות טריפנוצידיות בצורה קלה, מהירה וניתנת לשחזור.

Abstract

טריפנוזומה קרוזי היא הסוכן הסיבתי של מחלת צ’אגאס (ChD), מחלה אנדמית בעלת חשיבות לבריאות הציבור באמריקה הלטינית המשפיעה גם על מדינות רבות שאינן אנדמיות בשל העלייה בהגירה. מחלה זו משפיעה על כמעט 8 מיליון בני אדם, כאשר מספר הנדבקים החדשים מוערך ב-50,000 בשנה. בשנות ה-60 וה-70 של המאה ה-20 הוצגו שתי תרופות לטיפול ב-ChD: ניפורטימוקס ובנזנידזול (BZN). שניהם יעילים בתינוקות ובשלב החריף של המחלה אך לא בשלב הכרוני, והשימוש בהם קשור לתופעות לוואי חשובות. עובדות אלה מדגישות את הצורך הדחוף להגביר את החיפוש אחר תרופות חדשות נגד T. cruzi.

T. cruzi מועבר דרך וקטורים של חרקים hematophagous של משפחות Reduviidae ו- Hemiptera. ברגע שהוא נמצא בפונדקאי היונקים, הוא מתרבה באופן תוך-תאי כצורת האמאסטיגוטה הלא-מודבקת ומבדיל לתוך הטריפומסטיגטה, הצורה ההדבקה הלא-מכפילה את זרם הדם. בתוך וקטור החרקים, טריפומסטיגוטים הופכים לשלב האפימסטיגוטה ומתרבים באמצעות ביקוע בינארי.

מאמר זה מתאר בדיקה המבוססת על מדידת הפעילות של הציטופלסמית β-גלקטוזידאז המשתחררת לתרבית עקב ליזה של טפילים באמצעות המצע, כלורופנול אדום β-D-גלקטופירנוזיד (CPRG). לשם כך, זן T. cruzi Dm28c עבר טרנספקטציה עם פלסמיד בעל ביטוי יתר של β-גלקטוזידאז ומשמש לבדיקה פרמקולוגית במבחנה בשלבי אפימסטיגוטה, טריפומסטיגוטה ואמאסטיגוטה. מאמר זה מתאר גם כיצד למדוד את הפעילות האנזימטית באפימסטיגוטים בתרבית, בתאי Vero נגועים ב-amastigotes ובטריפומסטיגוטים ששוחררו מהתאים בתרבית באמצעות תרופת הייחוס, benznidazole, כדוגמה. בדיקה קולורימטרית זו מבוצעת בקלות וניתן לשנות את קנה המידה שלה לתבנית בתפוקה גבוהה ולהחיל אותה על זנים אחרים של T. cruzi .

Introduction

מחלת צ’אגאס (ChD), או טריפנוסומיאזיס אמריקאית, היא מחלה טפילית הנגרמת על ידי הפרוטוזואן המופלג, טריפנוסומה קרוזי (T. cruzi). ChD מתחיל עם שלב אקוטי אסימפטומטי או אוליגוסימפטומטי שבדרך כלל אינו מאובחן, ואחריו שלב כרוני לכל החיים. בכרוניות, כ-30% מהחולים מתגלים עשרות שנים לאחר ההדבקה – מגוון מצבים מתישים, כולל שריר הלב, תסמונות מגה-עיכוליות או שניהם, עם שיעור תמותה שנע בין 0.2% ל-20%1,2,3. חולים כרוניים אסימפטומטיים עשויים להיות ללא סימנים קליניים, אך הם נשארים סרופוסיטיים לאורך כל חייהם.

ההערכות מצביעות על כך שכ-7 מיליון בני אדם נדבקו ברחבי העולם, רובם מאמריקה הלטינית, שם ChD אנדמי. במדינות אלה, T. cruzi מועבר בעיקר באמצעות חרקי טריאטומין מוצצי דם נגועים (העברה הנישאת על ידי וקטורים) ופחות על ידי העברה דרך הפה דרך בליעה של מזון מזוהם בצואה triatomine המכילה את הטפילים2. בנוסף, הטפיל יכול להיות מועבר דרך השליה מאמהות chagasic לילודים, באמצעות עירויי דם, או במהלך השתלת איברים. דרכים בלתי תלויות וקטורים אלה לרכישת הזיהום וההגירה האנושית תרמו להתפשטות העולמית של המחלה, עדות למספר גדל והולך של מקרים בצפון אמריקה, אירופה, ובכמה מדינות אפריקאיות, מזרח ים תיכוניות ומערב האוקיינוס השקט4. ChD נחשבת למחלה מוזנחת שכן העברה הנישאת על ידי וקטורים קשורה קשר הדוק לעוני והיא נושא מוביל לבריאות הציבור, במיוחד במדינות בעלות הכנסה נמוכה באמריקה הלטינית. למרות שישנם טיפולים זמינים, התמותה עקב ChD באמריקה הלטינית היא הגבוהה ביותר בקרב מחלות טפיליות, כולל מלריה2.

ישנן שתי תרופות רשומות לטיפול ChD שהוצגו בסוף שנות ה-60 ותחילת שנות ה-70 של המאה ה-20: ניפורטימוקס ובנזנידזול5. שתי התרופות יעילות בשלב החריף של המחלה במבוגרים, ילדים ותינוקות נגועים מולדת, כמו גם בילדים עם זיהום כרוני, שם בדרך כלל מושגת תרופה. עם זאת, רק אנשים מעטים מאובחנים מוקדם מספיק כדי להיות מטופלים בזמן. על פי הניסויים הקליניים האחרונים, לשתי התרופות יש מגבלות חשובות במבוגרים והן לא היו יעילות בהפחתת הסימפטומים אצל אנשים עם מחלות כרוניות; לפיכך, השימוש בהם בשלב זה שנוי במחלוקת. חסרונות אחרים הם תקופות הטיפול הממושכות הנדרשות (60-90 יום) ותופעות הלוואי השכיחות והחמורות שנצפו, המובילות להפסקת הטיפול אצל חלק מהאנשים הנגועים 6,7. ההערכה היא כי פחות מ -10% מהאנשים עם ChD אובחנו, ועוד פחות מהם יש גישה לטיפול, שכן אנשים מושפעים רבים חיים באזורים כפריים ללא גישה או גישה נדירה לשירותי בריאות8. עובדות אלה מדגישות את הצורך הדחוף במציאת תרופות חדשות נגד T. cruzi כדי לאפשר טיפולים יעילים, בטוחים וישימים יותר בשטח, במיוחד עבור השלב הכרוני. בהקשר זה, אתגר נוסף בפיתוח תרכובות יעילות יותר הוא הגבלת המערכות להערכת יעילות התרופה במבחנה וב-in vivo9.

אף על פי שביולוגיה כימית וגישות גנומיות לזיהוי מטרות פוטנציאליות של תרופות שימשו בטפילים קינטופלסטיים, הכלים הגנומיים הזמינים ב- T. cruzi מוגבלים בניגוד ל – T. brucei או Leishmania. לפיכך, סינון של תרכובות עם פעילות טריפנוצידלית הוא עדיין הגישה הנפוצה ביותר בחיפוש אחר מועמדים חדשים לתרופות כימותרפיות נגד ChD. בדרך כלל, גילוי תרופות ב – T. cruzi חייב להתחיל בבדיקת ההשפעות של תרופה חדשה בבדיקה חוץ גופית נגד שלב האפימסטיגוטה. במשך עשרות שנים, הדרך היחידה למדוד את ההשפעות המעכבות של תרכובות מועמדות על T. cruzi הייתה ספירה מיקרוסקופית ידנית, שהיא מייגעת, גוזלת זמן ותלויה במפעיל. יתר על כן, גישה זו מתאימה לבדיקת מספר קטן של תרכובות, אך אינה מקובלת על סינון בתפוקה גבוהה של ספריות תרכובות גדולות. כיום, מחקרים רבים מתחילים בניתוח של מספר עצום של תרכובות ממקורות שונים שנבדקו במבחנה, ובודקים את יכולתם לעכב את צמיחת הטפילים. הן שיטות קולורימטריות והן שיטות פלואורומטריות פותחו כדי להגדיל את התפוקה במבחנים אלה, לשפר את האובייקטיביות של ההקרנה ולהפוך את התהליך כולו לפחות מייגע9.

אחת השיטות הקולורימטריות הנפוצות ביותר מבוססת על פעילות β-גלקטוזידאז של טפילים טרנספקטים שתוארו לראשונה על ידי Bucknet ומשתפי פעולה10. האנזים β-גלקטוזידאז המבוטא על ידי הטפילים הרקומביננטיים עושה הידרוליזה של המצע הכרומוגני, כלורופנול אדום β-D-גלקטופירנוזיד (CPRG), לכלורופנול אדום, שניתן למדוד בקלות בצבע באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-פלטה. לפיכך, צמיחת טפיל בנוכחות מגוון של תרכובות ניתן להעריך בו זמנית וכמות בלוחות microtiter. שיטה זו יושמה לבדיקת תרופות בצורות אפימסטיקוטה (הקיימות בווקטור החרקים), טריפומסטיגוטים, ואמאסטיגוטים תוך תאיים, שלבי היונקים של הטפיל. יתר על כן, מספר זני T. cruzi רקומביננטיים שעברו טרנספקטציה עם pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 פלסמיד (pLacZ)10 כדי לבטא את האנזים Escherichia coli β-galactosidase כבר זמינים (וניתן לבנות חדשים), המאפשר הערכה של טפילים מיחידות הקלדה נפרדות שונות (DTUs) שאולי לא יתנהגו באופן שווה כלפי אותן תרכובות 10,11,12,13 . שיטה זו כבר שימשה בהצלחה להערכת תרכובות לפעילות מול T. cruzi בסינון בתפוקה נמוכה וגבוהה12,13. גישות דומות שימשו גם בטפילים פרוטוזואנים אחרים, כולל טוקסופלזמה גונדי ולישמניה מקסיקנה14,15.

מאמר זה מתאר ומראה שיטה מפורטת לבדיקת תרופות במבחנה כנגד כל שלבי מחזור החיים של T. cruzi באמצעות טפילים המבטאים β-גלקטוזידאז. הבדיקות המוצגות כאן בוצעו עם קו T. cruzi מבטא β-galactosidase המתקבל על ידי טרנספקציה של זן T. cruzi Dm28c מ- DTU I13 עם פלסמיד pLacZ (Dm28c/ pLacZ). בנוסף, ניתן היה להתאים את אותו פרוטוקול בקלות לזנים אחרים כדי להשוות את הביצועים בין תרכובות ובין זני T. cruzi או DTUs.

Protocol

הערה: סקירה כללית של כל התכנון הניסיוני מתוארת באיור 1. איור 1: סקירה כללית של בדיקת הסינון במבחנה של קו Tripanosoma cruzi Dm28c/pLacZ תוך שימוש ב-CPRG כמצע לתגובה הקולורימטרית.</stro…

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל, β-galactosidase-מבטאי Dm28c epimastigotes היו דגירה עם 6 ריכוזים של BZN (2.5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (או תרכובות עניין) (או תרכובות עניין) במשך 72 שעות. לאחר תקופה זו נוסף ריאגנט CPRG יחד עם חומר ניקוי, אשר מזיז את התאים ומשחרר β-גלקטוזידאז. CPRG נבקע על ידי β-גלקטוזידאז כדי לייצר כלורופנול אדום, מה ש…

Discussion

מאמר זה מתאר בדיקה המבוססת על קביעת הפעילות הציטופלסמית β-גלקטוזידאז ששוחררה עקב תזה של T. cruzi epimastigotes, טריפומסטיגוטים, או תאים נגועים עם amastigotes בנוכחות המצע CPRG. השתמשנו בטפילי T. cruzi Dm28c/pLacZ, זן טפיל יציב המתקבל לאחר טרנספקציה עם פלסמיד נושא β-גלקטוזידאז שנבנה על ידי באקנר ומחבריו המ?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לד”ר באקנר על שסיפק בחביבות את הפלסמיד pLacZ. עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva מארגנטינה (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212), ומועצת המחקר של בריטניה [MR/P027989/1]. אמנות רפואית Servier שימשה ליצירת איור 1 (https://smart.servier.com).

Materials

1 L beaker Schott Duran 10005227
10 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP211010
5 mL serological pipette sterile Jet Biofil GSP010005
96-well plates Corning 3599
Benznidazole Sigma Aldrich 419656 N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide
Biosafty Cabinet Telstar Bio II A/P
Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile Tarson 546021
Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile Tarson 546041
CO2 Incubator Sanyo MCO-15A
CPRG Roche 10 884308001 Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside
DMEM, High Glucose Thermo Fisher Cientific 12100046 Powder
DMSO Sintorgan SIN-061 Dimethylsulfoxid
Fetal Calf Serum Internegocios SA FCS FRA 500 Sterile and heat-inactivated
G418 disulphate salt solution Roche G418-RO stock concentration: 50 mg/mL
Glucose D(+) Cicarelli 716214
Graduated cylinder Nalgene 3663-1000
Hemin Frontier Scientific H651-9
KCl Cicarelli 867212
Liver Infusion Difco 226920
Microcentrifuge tube 1.5 mL Tarson 500010-N
Microplate Spectrophotometer Biotek Synergy HTX
Na2HPO4 Cicarelli 834214
NaCl Cicarelli 750214
Neubauer chamber Boeco BOE 01
Nonidet P-40 Antrace NIDP40 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol
Prism Graphpad Statistical Analysis software
Sodium Bicarbonate Cicarelli 929211 NaHCO3
Sorvall ST 16 Centrifuge Thermo Fisher Cientific 75004380
T-25 flasks Corning 430639
Tryptose Merck 1106760500
Vero cells ATCC CRL-1587

参考文献

  1. Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies. Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).
  2. Pérez-Molina, J. A., Molina, I. Chagas disease. The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).
  3. Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).
  4. Steverding, D. The history of Chagas disease. Parasites & Vectors. 7, 317 (2014).
  5. Viotti, R., et al. Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).
  6. Bern, C. Chagas’ Disease. The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).
  7. Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. Methodological advances in drug discovery for Chagas disease. Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).
  8. Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).
  9. Vega, C., Rolón, M., Martínez-Fernández, A. R., Escario, J. A., Gómez-Barrio, A. A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase. Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).
  10. Bettiol, E., et al. Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).
  11. Gulin, J. E. N., et al. Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain. Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).
  12. da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
  13. McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).
  14. Moreno-Viguri, E., et al. In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).
  15. García, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).
  16. Vela, A., et al. In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).
  17. Alonso-Padilla, J., Rodríguez, A. High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).
  18. Martinez-Peinado, N., et al. Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity. Parasites & Vectors. 13 (1), 299 (2020).
  19. Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).
  20. Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., Gómez-Barrio, A. Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).

Play Video

記事を引用
Alonso, V. L., Manarin, R., Perdomo, V., Gulin, E., Serra, E., Cribb, P. In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing β-galactosidase. J. Vis. Exp. (177), e63210, doi:10.3791/63210 (2021).

View Video