In vitro Dépistage médicamenteux contre tous les stades du cycle de vie du trypanosoma cruzi à l’aide de parasites exprimant la β-galactosidase
概要
Nous décrivons un test colorimétrique à haut débit mesurant l’activité de la β-galactosidase à trois stades du cycle de vie de Trypanosoma cruzi, l’agent causal de la maladie de Chagas. Ce test peut être utilisé pour identifier les composés trypanocides de manière facile, rapide et reproductible.
Abstract
Trypanosoma cruzi est l’agent causal de la maladie de Chagas (ChD), une maladie endémique d’importance pour la santé publique en Amérique latine qui affecte également de nombreux pays non endémiques en raison de l’augmentation de la migration. Cette maladie touche près de 8 millions de personnes, avec de nouveaux cas estimés à 50 000 par an. Dans les années 1960 et 70, deux médicaments pour le traitement de la maladie coronarienne ont été introduits: le nifurtimox et le benznidazole (BZN). Les deux sont efficaces chez les nouveau-nés et pendant la phase aiguë de la maladie, mais pas dans la phase chronique, et leur utilisation est associée à des effets secondaires importants. Ces faits soulignent le besoin urgent d’intensifier la recherche de nouveaux médicaments contre T. cruzi.
T. cruzi est transmis par les insectes vecteurs hématophages des familles Reduviidae et Hemiptera. Une fois dans l’hôte mammifère, il se multiplie intracellulairement sous forme d’amastigote non flagellée et se différencie en trypomastigote, la forme infectieuse non réplicative de la circulation sanguine. À l’intérieur de l’insecte vecteur, les trypomastigotes se transforment au stade de l’épimastigote et se multiplient par fission binaire.
Cet article décrit un essai basé sur la mesure de l’activité de la β-galactosidase cytoplasmique libérée dans la culture en raison de la lyse des parasites en utilisant le substrat, le rouge chlorophénol β-D-galactopyranoside (CPRG). Pour cela, la souche T. cruzi Dm28c a été transfectée avec un plasmide surexprimant la β-galactosidase et utilisée pour le dépistage pharmacologique in vitro dans les stades épimastigote, trypomastigote et amastigote. Cet article décrit également comment mesurer l’activité enzymatique dans les épimastigotes en culture, les cellules Vero infectées avec des amastigotes et les trypomastigotes libérées par les cellules cultivées en utilisant le médicament de référence, le benznidazole, comme exemple. Ce test colorimétrique est facilement effectué et peut être mis à l’échelle à un format à haut débit et appliqué à d’autres souches de T. cruzi .
Introduction
La maladie de Chagas (ChD), ou trypanosomiase américaine, est une maladie parasitaire causée par le protozoaire flagellé, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). La maladie coronarienne commence par une phase aiguë asymptomatique ou oligosymptomatique qui n’est généralement pas diagnostiquée, suivie d’une phase chronique à vie. Dans la chronicité, ~ 30% des patients manifestent – des décennies après l’infection – une variété de conditions débilitantes, y compris la myocardiopathie, les méga-syndromes digestifs, ou les deux, avec un taux de mortalité allant de 0,2% à 20%1,2,3. Les patients chroniques asymptomatiques peuvent ne présenter aucun signe clinique, mais rester séropositifs tout au long de leur vie.
Les estimations suggèrent qu’environ 7 millions de personnes sont infectées dans le monde, principalement en Provenance d’Amérique latine, où la maladie coronarienne est endémique. Dans ces pays, T. cruzi est principalement transmis par des punaises triatomines hématophages infectées (transmission à transmission vectorielle) et moins fréquemment par transmission orale par l’ingestion d’aliments contaminés par des excréments de triatomines contenant les parasites2. De plus, le parasite peut être transmis par le placenta des mères chagasiques aux nouveau-nés, par transfusion sanguine ou lors d’une transplantation d’organe. Ces moyens indépendants du vecteur de contracter l’infection et la migration humaine ont contribué à la propagation mondiale de la maladie, comme en témoigne un nombre croissant de cas en Amérique du Nord, en Europe et dans certains pays d’Afrique, de la Méditerranée orientale et du Pacifique occidental4. La maladie coronarienne est considérée comme une maladie négligée, car la transmission à transmission vectorielle est étroitement associée à la pauvreté et constitue un problème de santé publique majeur, en particulier dans les pays à faible revenu d’Amérique latine. Bien qu’il existe des traitements disponibles, la mortalité due à la maladie coronarienne en Amérique latine est la plus élevée parmi les maladies parasitaires, y compris le paludisme2.
Il existe deux médicaments homologués pour le traitement de la coronaropathie introduits à la fin des années 1960 et au début des années 1970 : le nifurtimox et le benznidazole5. Les deux médicaments sont efficaces dans la phase aiguë de la maladie chez les adultes, les enfants et les nouveau-nés infectés congénitalement, ainsi que chez les enfants atteints d’une infection chronique, où la guérison est généralement obtenue. Cependant, seules quelques personnes sont diagnostiquées assez tôt pour être traitées à temps. Selon les derniers essais cliniques, les deux médicaments ont des limites importantes chez les adultes et étaient inefficaces pour réduire les symptômes chez les personnes atteintes de maladies chroniques; par conséquent, leur utilisation à ce stade est controversée. D’autres inconvénients sont les périodes de traitement prolongées requises (60-90 jours) et les effets indésirables fréquents et graves observés, qui conduisent à l’arrêt du traitement chez une proportion de personnes infectées 6,7. On estime que moins de 10 % des personnes atteintes de coronaropathie ont été diagnostiquées, et encore moins ont accès à un traitement, car de nombreuses personnes touchées vivent dans des zones rurales où l’accès aux soins de santé est inexistant ou rare8. Ces faits soulignent le besoin urgent de trouver de nouveaux médicaments contre T. cruzi pour permettre des traitements plus efficaces, sûrs et applicables sur le terrain, en particulier pour la phase chronique. À cet égard, un autre défi dans le développement de composés plus efficaces est la limitation des systèmes d’évaluation de l’efficacité des médicaments in vitro et in vivo9.
Bien que la biologie chimique et les approches génomiques pour l’identification de cibles médicamenteuses potentielles aient été utilisées chez les parasites kinétoplastes, les outils génomiques disponibles chez T. cruzi sont limités contrairement à T. brucei ou Leishmania. Ainsi, le criblage des composés ayant une activité trypanocide reste l’approche la plus utilisée dans la recherche de nouveaux candidats médicaments chimiothérapeutiques contre la maladie de Huntington. Habituellement, la découverte de médicaments chez T. cruzi doit commencer par tester les effets d’un nouveau médicament dans un essai in vitro contre le stade épimastigote. Pendant des décennies, la seule façon de mesurer les effets inhibiteurs des composés candidats sur T. cruzi était le comptage microscopique manuel, qui est laborieux, long et dépendant de l’opérateur. De plus, cette approche convient pour l’analyse d’un petit nombre de composés, mais est inacceptable pour le criblage à haut débit de grandes bibliothèques de composés. De nos jours, de nombreuses recherches commencent par l’analyse d’un grand nombre de composés de différentes origines qui sont testés in vitro, testant leur capacité à inhiber la croissance des parasites. Des méthodes colorimétriques et fluorométriques ont été développées pour augmenter le débit dans ces essais, améliorant l’objectivité du criblage et rendant l’ensemble du processus moins fastidieux9.
L’une des méthodes colorimétriques les plus largement utilisées est basée sur l’activité β-galactosidase des parasites transfectés décrite pour la première fois par Bucknet et ses collaborateurs10. L’enzyme β-galactosidase exprimée par les parasites recombinants hydrolyse le substrat chromogène, le rouge chlorophénol β-D-galactopyranoside (CPRG), en rouge chlorophénol, qui peut être facilement mesuré colorimétriquement à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques. Ainsi, la croissance des parasites en présence d’une variété de composés peut être simultanément évaluée et quantifiée dans des plaques de microtitrage. Cette méthode a été appliquée pour tester des médicaments sous forme d’épimastigote (présents dans l’insecte vecteur), des trypomastigotes et des amastigotes intracellulaires, les stades mammifères du parasite. De plus, plusieurs souches recombinantes de T. cruzi transfectées avec le plasmide pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 (pLacZ)10 pour exprimer l’enzyme Escherichia coli β-galactosidase sont déjà disponibles (et de nouvelles peuvent être construites), ce qui permet d’évaluer les parasites de différentes unités de typage discrètes (DTU) qui peuvent ne pas se comporter également envers les mêmes composés 10,11,12,13 . Cette méthode a déjà été utilisée avec succès pour évaluer l’activité des composés contre T. cruzi dans le criblage à faible et à haut débit12,13. Des approches similaires ont également été utilisées chez d’autres parasites protozoaires, notamment Toxoplasma gondii et Leishmania mexicana14,15.
Cet article décrit et montre une méthode détaillée pour un dépistage in vitro des médicaments contre tous les stades du cycle de vie de T. cruzi en utilisant des parasites exprimant β-galactosidase. Les essais présentés ici ont été réalisés avec une lignée T. cruzi exprimant la β-galactosidase obtenue par transfection de la souche T. cruzi Dm28c du DTU I13 avec du plasmide pLacZ (Dm28c/pLacZ). De plus, le même protocole pourrait être facilement adapté à d’autres souches pour comparer les performances entre les composés et entre les souches de T. cruzi ou DTU.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit un test basé sur la détermination de l’activité cytoplasmique de la β-galactosidase libérée par la lyse membranaire des épimastigotes de T. cruzi, des trypomastigotes ou des cellules infectées par des amastigotes en présence du substrat CPRG. Nous avons utilisé des parasites T. cruzi Dm28c/pLacZ, une souche parasitaire stable obtenue après transfection avec un plasmide contenant de la β-galactosidase construit par Buckner et les co-auteurs10. Ce …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Buckner d’avoir aimablement fourni le plasmide pLacZ. Ce travail a été soutenu par Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva d’Argentine (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) et Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art a été utilisé pour produire la figure 1 (https://smart.servier.com).
Materials
| 1 L beaker | Schott Duran | 10005227 | |
| 10 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP211010 | |
| 5 mL serological pipette sterile | Jet Biofil | GSP010005 | |
| 96-well plates | Corning | 3599 | |
| Benznidazole | Sigma Aldrich | 419656 | N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide |
| Biosafty Cabinet | Telstar | Bio II A/P | |
| Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile | Tarson | 546021 | |
| Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile | Tarson | 546041 | |
| CO2 Incubator | Sanyo | MCO-15A | |
| CPRG | Roche | 10 884308001 | Chlorophenol Red-β-D-galactopyranoside |
| DMEM, High Glucose | Thermo Fisher Cientific | 12100046 | Powder |
| DMSO | Sintorgan | SIN-061 | Dimethylsulfoxid |
| Fetal Calf Serum | Internegocios SA | FCS FRA 500 | Sterile and heat-inactivated |
| G418 disulphate salt solution | Roche | G418-RO | stock concentration: 50 mg/mL |
| Glucose D(+) | Cicarelli | 716214 | |
| Graduated cylinder | Nalgene | 3663-1000 | |
| Hemin | Frontier Scientific | H651-9 | |
| KCl | Cicarelli | 867212 | |
| Liver Infusion | Difco | 226920 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Tarson | 500010-N | |
| Microplate Spectrophotometer | Biotek | Synergy HTX | |
| Na2HPO4 | Cicarelli | 834214 | |
| NaCl | Cicarelli | 750214 | |
| Neubauer chamber | Boeco | BOE 01 | |
| Nonidet P-40 | Antrace | NIDP40 | 2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol |
| Prism | Graphpad | Statistical Analysis software | |
| Sodium Bicarbonate | Cicarelli | 929211 | NaHCO3 |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Cientific | 75004380 | |
| T-25 flasks | Corning | 430639 | |
| Tryptose | Merck | 1106760500 | |
| Vero cells | ATCC | CRL-1587 |
参考文献
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