Este protocolo describe un método para establecer un modelo in vitro de barrera hematoencefálica humana (BHE). Las células endoteliales y los pericitos se siembran a cada lado de un filtro de inserción (compartimento sanguíneo), y los astrocitos se siembran en el pozo inferior (compartimento cerebral). El modelo caracterizado se utilizó para experimentos de transporte de nanopartículas.
La administración de medicamentos al cerebro sigue siendo un desafío debido a las propiedades altamente específicas y restrictivas de la barrera hematoencefálica (BBB), que controlan y restringen el acceso al parénquima cerebral. Sin embargo, con el desarrollo de las nanotecnologías, se desarrollaron grandes paneles de nuevos nanomateriales para mejorar la administración de fármacos, destacando la necesidad de microsistemas in vitro confiables para predecir la penetración cerebral en el marco de ensayos preclínicos. Aquí hay un método sencillo para configurar un sistema microfisiológico para modelar la barrera hematoencefálica utilizando únicamente células humanas. En su configuración, el modelo consiste en un triple cultivo que incluye células endoteliales similares al cerebro (BLC), pericitos y astrocitos, los tres principales actores celulares BBB necesarios para inducir y regular las propiedades de BBB de una manera más fisiológica sin el requisito de apretar compuestos. El modelo desarrollado en un formato de placa de 12 pocillos, listo después de 6 días de triple cultivo, se caracteriza por propiedades físicas, expresiones genéticas y proteicas y se utiliza para la medición del transporte de nanogel polimérico. El modelo se puede utilizar para una amplia gama de experimentos en condiciones saludables y patológicas y representa una herramienta valiosa para las evaluaciones preclínicas del transporte de moléculas y partículas, así como el tráfico inter e intracelular.
La BHE, localizada a nivel de las células endoteliales capilares cerebrales (CE), controla y regula el acceso al parénquima cerebral, que es crucial para mantener la homeostasis cerebral y la función de las células neuronales 1,2. Sin embargo, en el caso de la patología cerebral, la falta de acceso al parénquima cerebral representa un obstáculo real para desarrollar estrategias terapéuticas.
Las CE BBB poseen un conjunto complejo de propiedades, incluyendo proteínas de unión estrecha (TJ), que sellan el espacio intercelular, asociadas con un sistema de bombas de elujo, transportadores específicos y receptores, que controlan la vía transcelular 1,2,3. Además, todas estas propiedades son inducidas y mantenidas, gracias a las comunicaciones con los pericitos incrustados en la membrana basal de BBB EC y los astrocitos, cuyos patas terminales rodean los capilares cerebrales 1,2,3. Por lo tanto, el estudio de la BHE in vitro es un desafío considerando la complejidad de su arquitectura y las comunicaciones entre los diferentes tipos celulares que constituyen la unidad neurovascular (NVU)2. Además, los diferentes tipos de células son cruciales para la inducción y el mantenimiento de las propiedades de la BHE y, en consecuencia, afectan la predicción del cruce a través de la BHE. Diferentes estrategias para la administración de fármacos al cerebro ya fueron probadas utilizando un gran panel de tácticas para eludir las propiedades restringidas de BBB4. Más recientemente, con el progreso de las nanotecnologías, se están desarrollando nuevos materiales para aplicaciones como portadores de fármacos 5,6. Además de su mayor carga, menor toxicidad y mayor biodisponibilidad de los fármacos, estos nuevos nanomateriales pueden ser funcionalizados para una estrategia de caballo de Troya para cruzar la barrera hematoencefálica y dirigirse específicamente a las células en el parénquima 5,6. Entre los diferentes tipos de nanomateriales que se están evaluando, los nanogeles han atraído considerable atención, principalmente debido a sus propiedades coloidales y su capacidad para adaptar la estructura química para introducir propiedades sensibles a estímulos 7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Ahora se desarrollan modelos in vitro para estudios preclínicos con células humanas para predecir la penetración cerebral de fármacos16. Diferentes configuraciones de estos modelos están disponibles, desde monocapas de CE cerebrales hasta sistemas celulares múltiples16. Teniendo en cuenta la importancia de las células NVU en la inducción y mantenimiento de la BHE y la respuesta coordinada al ambiente patológico, los modelos in vitro de BHE necesitan considerar todos estos protagonistas para mejorar la relevancia de la predicción 2,17.
El método actual describe la creación de un modelo de triple cultivo in vitro de la barrera hematoencefálica humana, que está completamente desarrollado con células humanas para estudiar mecanismos moleculares celulares y humanos específicos. Para ser fisiológicamente relevante, el modelo consiste en los tres principales actores celulares de la BHE (CE, pericitos y astrocitos) necesarios para inducir y mantener las propiedades de la BHE, sin el uso de compuestos tensores y mostrando un conjunto de propiedades requeridas para ser considerado como un modelo de BBB in vitro 16,18. El modelo se configura en una configuración que delimita el compartimento sanguíneo y cerebral, adecuado para estudios preclínicos de transporte de fármacos y partículas para predecir la penetración cerebral. La utilidad del modelo se ilustra midiendo el transporte de nanogeles poliméricos.
El tratamiento de las enfermedades cerebrales sigue siendo un desafío teniendo en cuenta la dificultad de los fármacos para superar la barrera hematoencefálica para alcanzar sus objetivos celulares y moleculares en el parénquima cerebral.
El desarrollo de fármacos para enfermedades cerebrales actualmente exhibe una baja tasa de éxito ya que la mayoría de los medicamentos que muestran resultados prometedores en modelos preclínicos no mostraron ningún beneficio cuando se usan en la clínica. Siguiendo la “regla de las 3R”, que tiene como objetivo reducir el número de animales utilizados para la experimentación, se desarrollan modelos in vitro de la BBB para estudiar patologías cerebrales y predecir la penetración cerebral de drogas29. Los modelos in vitro de BBB se han desarrollado principalmente utilizando células animales y se han vuelto más sofisticados para mejorar la relevancia de los resultados obtenidos16. Uno de los avances significativos en el uso de células humanas, que aporta una nueva visión innegable y más especificidad, a nivel celular y molecular, para estudiar los mecanismos de la enfermedad humana16. Sin embargo, el desarrollo de modelos relevantes requiere considerar la mejora de la configuración del modelo in vitro de BBB y el conocimiento que surge, gracias a los modelos animales. Por lo tanto, es necesario considerar la complejidad de la arquitectura BBB y la importancia de las comunicaciones célula-célula para estudiar la BBB en condiciones fisiológicas y patológicas30.
El protocolo presentado aquí describe un método para establecer un modelo completo de BBB jp vivo humano que comprende los tres tipos principales de células de la BBB, sin limitación de acceso al tejido cerebral. Como sistema celular múltiple, la inducción y el mantenimiento de las propiedades de la BHE, sin el uso artificial de compuestos tensores, sino inducidos por las comunicaciones célula-célula es fisiológicamente más relevante y en línea con la inducción in vivo de las propiedades de la BHE31. Por lo tanto, el respeto de la cronología del protocolo es primordial de importancia para el éxito del protocolo. Además, los tiempos de incubación durante el ajuste del triple cultivo y una vez que se ensamblan los tres tipos de células representan los principales pasos críticos del protocolo.
Las propiedades de BBB en CE son inducidas por el cocultivo con pericitos, como se describe para el modelo de cocultivo24. Por lo tanto, el cultivo de pericitos en el reverso del filtro de inserción es el punto más crítico y requiere seguir estrictamente el protocolo a riesgo de no tener suficientes pericitos para la inducción de las propiedades de BBB. En primer lugar, durante el procedimiento de recubrimiento y también la siembra celular, se debe tener cuidado de no tener la cubierta de la placa de Petri en contacto con el recubrimiento y también el medio una vez que las células están sembradas para garantizar un buen recubrimiento del filtro y no perder células (pasos 2.2.1 y 2.2.4). Además, una vez sembrados los pericitos, es esencial esperar el tiempo indicado para la unión de los pericitos (paso 2.2.4) antes de revertir el filtro de inserción para el recubrimiento y siembra de CE en el otro lado (pasos 2.2.5 y 2.3). Una vez sembrado, se requieren seis días para inducir las propiedades de la barrera hematoencefálica a través de las comunicaciones célula-célula (paso 2.4).
El modelo se valida en términos de permeabilidad restringida (asociada al ajuste de las uniones estrechas) ya que las CE del modelo de triple cultivo muestran valores de permeabilidad a los marcadores de integridad BBB similares al modelo de cocultivo validado y también medidos en modelos animales o humanos validados 16,27,32. Además, la validación de un modelo de BBB in vitro requiere, además de la permeabilidad restringida, la capacidad de respuesta a otros tipos celulares de la NVU y la expresión de receptores y transportadores funcionales16. Además, el modelo es reproducible y produce múltiples filtros de inserción y pocillos para realizar numerosos análisis (expresión génica y proteica, tinción fluorescente, pruebas de toxicidad) en cada tipo de célula por separado sin requerir un método de clasificación celular.
El modelo se desarrolló utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,4 μm para tener un tipo de celda a cada lado del filtro de inserto. El sistema de filtro de inserción permitió el estudio de las comunicaciones célula-célula en condiciones fisiológicas transfiriéndolo sobre astrocitos que contenían bien. La presencia de astrocitos en el sistema representa un valor positivo en comparación con el modelo inicial de cocultivo in vitro 24. De hecho, teniendo en cuenta la importancia de los astrocitos en la fisiología de la BHE, este tercer tipo de célula permite una mayor comprensión de las comunicaciones célula-célula dentro de la BHE. Además, el sistema de cultivo celular triple también puede ser estudiado en condiciones patológicas como el accidente cerebrovascular, en el que los astrocitos juegan un papel esencial33,34,35. Además, el diseño de BLECs/pericitos en ambos lados del filtro de inserción se puede colocar fácilmente sobre otros tipos de células para imitar condiciones patológicas como el cáncer cerebral23.
El tamaño de poro del filtro de inserción puede traer limitaciones con algunos experimentos, como la transmigración celular a través de la barrera hematoencefálica. Sin embargo, el desarrollo del modelo con un tamaño de poro mayor requiere la adaptación del protocolo para asegurar la formación de una monocapa fisiológica de EC y no de múltiples capas, lo cual no es fisiológicamente relevante para imitar la BBB36.
La aplicabilidad del modelo se ha demostrado utilizando el experimento de transporte NG que muestra la posibilidad de realizar un experimento de transporte utilizando un sistema multicelular. Sin embargo, uno debe ser consciente de las dificultades de tener un compuesto de control o molécula para el experimento de transporte, compartiendo propiedades comparables con NG ya que cada nanoestructura exhibe un conjunto único de propiedades (peso molecular, carga, forma, propiedades físicas, formación de corona de proteínas).
Una limitación del modelo es la ausencia de esfuerzo cortante, que se demostró que influye en la diferenciación de las CE y en la expresión de proteínas TJ37. Sin embargo, desarrollar un sistema fluídico que imite el capilar cerebral es un desafío considerando la complejidad de agregar una parte fluídica, que requiere un dispositivo específico, en un sistema de múltiples células. Además, el dispositivo en particular generalmente no está disponible comercialmente y no permite muchas réplicas, lo que hace que los sistemas fluídicos estén menos adaptados para el uso de alto rendimiento.
En resumen, este sistema de triple cultivo formado por células humanas reproduce in vitro la arquitectura de la BBB. Permite la generación de muchos insertos que se pueden utilizar para el cribado extensivo de compuestos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo es otorgado por el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención No 764958, como parte del proyecto NANOSTEM, una Red de Formación Innovadora Marie Skłodowska-Curie (ITN) (Beca Eleonora Rizzi). Este estudio es concedido por el «Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais» (Beca de Clémence Deligne), la “Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l’Enfant et de l’adolescent” (SFCE), la Association “l’étoile de Martin” y la Association “Cassandra contre la leucémie”.
Cell Culture | |||
Astocyte Medium (AM) | ScienCell | 1801 | |
Astrocyte Growth Supplement | ScienCell | 1852 | Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set. |
Cell culture dish 100 mm | Corning | 430293 | 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting |
Cell culture dish 150 mm | Corning | 430599 | The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model. |
Collagen I | Corning | 354236 | Rat tail |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 31600-083 | Powder |
Endothelial Cell Growth Supplement | ScienCell | 1051 | Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set. |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fetal Calf Serum | Sigma | F7524 | |
Gelatin | Sigma | G2500 | 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF |
Gentamicin | BiochromA6 | A-2712 | |
Glucose | Sigma | G6152 | Powder |
Glutamine | Merck | 1002891000 | |
Human Brain Cortex Astrocytes | ScienCell | 1800-SC | |
Malassez cell counting chamber | vWR | HECH40453702 | The count was performed manually. |
Matrigel | Corning | 354230 | Extracellular matrix-based hydrogel |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 0503 | Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets. |
Poly-L-lysine | ScienCell | 0413 | |
Steritop | Millipore System | SCGPT0SRE | 0.22 µm pore size |
Transwell insert | Corning | 3401 | 0.4 µm pore polycarbonate filter |
Trypsin/EDTA neutralization solution | ScienCell | 0113 | |
Trypsin/EDTA solution | ScienCell | 0103 | |
Immunocytochemistry | |||
SEA BLOCK blocking buffer | ThermoScientific | 37527 | |
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody | Thermofisher | A11031 | Dilution 1:500 |
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody | Thermofisher | A11036 | Dilution 1:500 |
Anti-Claudin-5 primary antibody | InVitrogen | 34-1600 | Dilution 1:100 |
Anti-Desmin primary antibody | Abcam | ab6322 | Dilution 1:200 |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody | Dako | Z0334 | Dilution 1:500 |
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody | Abcam | ab51090 | Dilution 1:200 |
Anti-VE-cadherin primary antibody | Abcam | ab207732 | Dilution 1:200 |
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody | InVitrogen | 61-7300 | Dilution 1:200 |
Normal Goat Serum | Sigma | G6767 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36962 | |
Gene expression | |||
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit | Macherey-Nagel | 740,933,250 | |
96 multiplate well | Biorad | HSP9601 | |
iSCRIPT | Biorad | 1708841 | |
Sealer sheet | Biorad | MSB1001 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | Biorad | 172-5201 | |
Protein expression | |||
2x Laemli Sample Buffer | Biorad | 161-0737 | Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay. |
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody | Abcam | ab207732 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Claudin-5 primary antibody | Abcam | ab15106 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody | Millipore | 07-1401 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Mouse secondary antibody | Dako | P0447 | Dilution 1:5000 in TBS-Tween |
Anti-P-glycoprotein primary antibody | Genetex | GTX23364 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT |
Anti-Rabbit secondary antibody | Dako | P0448 | Dilution 1:8000 in TBS-Tween |
Anti-Transferrin Receptor primary antibody | Abcam | ab84036 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Zona occludens-1 primary antibody | Abcam | ab216880 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Criterion TGX Gel | Biorad | 5678083 | |
ECL Prime Solution | Amersham | RPN2236 | Revelation solution to keep in the dark |
Phospatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
Phospatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
Protease Inhibitor | Sigma | P8340 | |
Protein Standards | Biorad | 161-0373 | Molecular weight markers |
RIPA 10x | Millipore | 20-188 | |
TBS 10x | Biorad | 1706435 | |
TRIS-Glycine | Biorad | 1610771 | |
Tween | Biorad | 1706531 | |
BBB integrity assay | |||
Sodium Fluorescein | Ampresco | 0681 | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Elacridar | Sigma | SML0486 | GF120918 |
FITC-Dextran 20 kDa | Sigma | FD-20S | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Rhodamine 123 | Sigma | R8004 | λex= 501 nm; λem= 538 nm |
SynergyTM H1 | BioTek Instruments | Fluorescent multiplate reader | |
Nanogel Transport | |||
Syringe | Terumo | SS+01T1 | 1 mL syringe |
Filter | FisherScientific | 15161499 | 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter |
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels | The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. |