Bu protokol, in vitro model bir insan kan-beyin bariyeri (BBB) oluşturmak için bir yöntem açıklar. Endotel hücreleri ve perisitler bir kesici uç filtrenin (kan bölmesi) her iki tarafına ekilir ve astrositler alt kuyucuğa (beyin bölmesi) ekilir. Karakterize edilen model, nanopartikül taşıma deneyleri için kullanılmıştır.
İlaçların beyne verilmesi, beyin parankimine erişimi kontrol eden ve kısıtlayan kan-beyin bariyerinin (BBB) son derece spesifik ve kısıtlayıcı özellikleri nedeniyle bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, nanoteknolojilerin gelişmesiyle birlikte, ilaç dağıtımını iyileştirmek için yeni nanomalzemelerden oluşan büyük paneller geliştirildi ve klinik öncesi tahliller çerçevesinde beyin penetrasyonunu tahmin etmek için güvenilir in vitro mikrosistemlere duyulan ihtiyacı vurguladı. İşte BBB’yi yalnızca insan hücrelerini kullanarak modellemek için mikrofizyolojik bir sistem kurmak için basit bir yöntem. Konfigürasyonunda, model, beyin benzeri endotel hücreleri (BLEC’ler), perisitler ve astrositler, BBB özelliklerini sıkılaştırma bileşiklerine ihtiyaç duymadan daha fizyolojik bir şekilde indüklemek ve düzenlemek için gerekli üç ana BBB hücresel aktörü içeren üçlü bir kültürden oluşur. 6 günlük üçlü kültürden sonra hazır olan 12 delikli plaka formatında geliştirilen model, fiziksel özellikler, gen ve protein ifadelerinde karakterize edilir ve polimerik nanojel taşıma ölçümü için kullanılır. Model, sağlıklı ve patolojik koşullarda çok çeşitli deneyler için kullanılabilir ve molekül ve parçacık taşımacılığının klinik öncesi değerlendirmelerinin yanı sıra hücreler arası ve hücre içi kaçakçılık için değerli bir araçtır.
Beyin kılcal endotel hücreleri (ECs) düzeyinde lokalize olan BBB, beyin homeostazını ve sinir hücrelerinin işlevini korumak için çok önemli olan beyin parankimine erişimi kontrol eder ve düzenler 1,2. Bununla birlikte, beyin patolojisi durumunda, beyin parankimine erişim eksikliği, terapötik stratejilerin geliştirilmesinde gerçek bir engel teşkil etmektedir.
BBB ECs, hücreler arası alanı kapatan, hücreler arası yolu 1,2,3 kontrol eden bir efflux pompaları, spesifik taşıyıcılar ve reseptörler sistemi ile ilişkili sıkı bağlantı (TJ) proteinleri de dahil olmak üzere karmaşık bir dizi özelliğe sahiptir. Dahası, tüm bu özellikler, BBB EC bazal membranına gömülü perisitler ve uç ayakları beyin kılcal damarlarını çevreleyen astrositlerle iletişim sayesinde indüklenir ve korunur 1,2,3. Bu nedenle, BBB’nin in vitro olarak incelenmesi, mimarisinin karmaşıklığı ve nörovasküler birimi (NVU) oluşturan farklı hücre tipleri arasındaki iletişim göz önüne alındığında bir zorluktur2. Dahası, farklı hücre tipleri BBB özelliklerinin indüksiyonu ve bakımı için çok önemlidir ve sonuç olarak BBB’den geçişin tahminini etkiler. Beyne ilaç dağıtımı için farklı stratejiler, BBB kısıtlı özelliklerini atlamak için büyük bir taktik paneli kullanılarak test edildi4. Daha yakın zamanlarda, nanoteknolojilerin ilerlemesiyle birlikte, ilaç taşıyıcıları 5,6 gibi uygulamalar için yeni malzemeler geliştirilmektedir. Daha yüksek yüklerine, azaltılmış toksisitelerine ve artan ilaçların biyoyararlanımına ek olarak, bu yeni nanomalzemeler, BBB’yi geçmek ve özellikle parankimdeki hücreleri hedeflemek için bir Truva atı stratejisi için işlevselleştirilebilir 5,6. Değerlendirilen farklı nanomalzeme türleri arasında, nanojeller, esas olarak kolloidal özellikleri ve kimyasal yapıyı uyaranlara duyarlı özellikleri 7,8,9,10,11,12,13,14,15 tanıtmak için uyarlama yetenekleri nedeniyle oldukça dikkat çekmiştir.
İn vitro modeller, ilaçların beyin penetrasyonunu tahmin etmek için insan hücrelerini kullanan preklinik çalışmalar için geliştirilmiştir16. Bu modellerin farklı ayarları mevcuttur, beyin EC’lerinin tek katmanlarından çoklu hücre sistemlerine kadar16. NVU hücrelerinin BBB indüksiyonu ve bakımındaki önemi ve patolojik ortama koordineli yanıt göz önüne alındığında, BBB in vitro modellerinin,tahminin alaka düzeyini artırmak için tüm bu kahramanları göz önünde bulundurması gerekir 2,17.
Mevcut yöntem, belirli hücresel ve insan moleküler mekanizmalarını incelemek için insan hücreleriyle tamamen geliştirilen insan BBB’sinin üçlü bir kültür in vitro modelinin kurulmasını açıklamaktadır. Fizyolojik olarak alakalı olmak için, model, BBB özelliklerini indüklemek ve sürdürmek için gerekli olan BBB’nin ana üç hücresel aktöründen (ECs, perisitler ve astrositler), sıkılaştırıcı bileşikler kullanılmadan ve in vitro BBB model16,18 olarak kabul edilmesi gereken bir dizi özellik göstermeden oluşur. Model, beyin penetrasyonunu tahmin etmek için ilaç ve parçacık taşımacılığının klinik öncesi çalışmaları için uygun, kan ve beyin bölmesini sınırlayan bir konfigürasyonda kurulmuştur. Modelin kullanışlılığı, polimerik nanojellerin taşınmasını ölçerek gösterilmiştir.
Beyin hastalıklarının tedavisi, ilaçların beyin parankimindeki hücresel ve moleküler hedeflerine ulaşmak için BBB’yi engelleme zorluğu göz önüne alındığında bir zorluk olmaya devam etmektedir.
Beyin hastalıkları için ilaç geliştirme şu anda düşük bir başarı oranı sergilemektedir, çünkü klinik öncesi modellerde umut verici sonuçlar veren ilaçların çoğu klinikte kullanıldığında herhangi bir fayda göstermemektedir. Deney için kullanılan hayvan sayısını azaltmayı amaçlayan “3R kuralını” takiben, beyin patolojilerini incelemek ve ilaçların beyin penetrasyonunu tahmin etmek için BBB’nin in vitro modelleri geliştirilmiştir29. BBB’nin in vitro modelleri esas olarak hayvan hücreleri kullanılarak geliştirilmiştir ve elde edilen sonuçların alaka düzeyini artırmak için daha sofistike hale gelmiştir16. İnsan hücrelerinin kullanımındaki önemli gelişmelerden biri, insan hastalık mekanizmalarını incelemek için hücresel ve moleküler düzeylerde inkar edilemez yeni bir anlayış ve daha fazla özgüllük getiriyor16. Bununla birlikte, ilgili modellerin geliştirilmesi, BBB in vitro model ayarlarının iyileştirilmesini ve hayvan modelleri sayesinde ortaya çıkan bilginin dikkate alınmasını gerektirir. Bu nedenle, BBB mimarisinin karmaşıklığını ve BBB’yi fizyolojik ve patolojik koşullar altında incelemek için hücre-hücre iletişiminin önemini göz önünde bulundurması gerekir30.
Burada sunulan protokol, beyin dokusuna erişim sınırlaması olmaksızın, BBB’nin üç ana hücre tipini içeren tam bir insan BBB in vitro modeli kurmak için bir yöntem tanımlamaktadır. Çoklu hücre sistemi olarak, sıkma bileşiklerinin yapay kullanımı olmadan, ancak bunun yerine hücre-hücre iletişimi tarafından indüklenen BBB özelliklerinin indüksiyonu ve korunması, fizyolojik olarak daha alakalı ve BBB özelliklerinin in vivo indüksiyonu ile uyumludur31. Bu nedenle, protokolün kronolojisine saygı gösterilmesi, protokolün başarısı için çok önemlidir. Ayrıca, üçlü kültürün ayarlanması sırasında ve üç hücre tipi bir araya getirildikten sonra kuluçka süreleri, protokolün ana kritik adımlarını temsil eder.
EC’lerdeki BBB özellikleri, ortak kültür modeli24 için açıklandığı gibi, perisitlerle ortak kültür tarafından indüklenir. Bu nedenle, kesici uç filtresinin arka tarafındaki perisitlerin kültürü en kritik noktadır ve BBB özelliklerinin indüksiyonu için yeterli perisitlere sahip olmama riski altında protokolün sıkı bir şekilde takip edilmesini gerektirir. Her şeyden önce, kaplama prosedürü ve ayrıca hücre tohumlaması sırasında, filtrenin iyi bir şekilde kaplanmasını sağlamak ve hücreleri kaybetmemek için Petri kabının kapağının kaplama ile temas etmemesine ve ayrıca hücreler tohumlandıktan sonra ortama dikkat edilmelidir (adım 2.2.1 ve 2.2.4). Ayrıca, perisitler tohumlandıktan sonra, diğer taraftaki EC’lerin kaplanması ve tohumlanması için kesici uç filtresini geri döndürmeden önce perisitlerin bağlanması için belirtilen süreyi beklemek önemlidir (adım 2.2.4) (adım 2.2.5 ve 2.3). Tohumlandıktan sonra, hücre-hücre iletişimi yoluyla BBB özelliklerini indüklemek için altı gün gerekir (adım 2.4).
Model, sınırlı geçirgenlik açısından doğrulanmıştır (sıkı bağlantıların ayarlanmasıyla ilişkili), çünkü üçlü kültür modelinin EC’leri, doğrulanmış ortak kültür modeline benzer BBB bütünlük belirteçlerine geçirgenlik değerleri gösterir ve ayrıca doğrulanmış hayvan veya insan modellerinde ölçülür 16,27,32. Ayrıca, bir in vitro BBB modelinin doğrulanması, sınırlı geçirgenliğe ek olarak, NVU’nun diğer hücre tiplerine yanıt vermeyi ve fonksiyonel reseptörlerin ve taşıyıcıların ekspresyonunu gerektirir16. Ek olarak, model tekrarlanabilir ve bir hücre sıralama yöntemi gerektirmeden her hücre tipi üzerinde ayrı ayrı çok sayıda analiz (gen ve protein ekspresyonu, floresan boyama, toksisite testleri) gerçekleştirmek için birden fazla kesici uç filtresi ve kuyucuk üretir.
Model, kesici uç filtresinin her iki tarafında bir hücre tipine sahip olmak için 0,4 μm gözenek boyutunda bir filtre kullanılarak geliştirilmiştir. Kesici uç filtre sistemi, hücre-hücre iletişiminin fizyolojik koşullarda, iyi içeren astrositler üzerine aktarılarak incelenmesine izin verdi. Sistemdeki astrositlerin varlığı, in vitro model 24’teki ilk ortak kültüre kıyasla artı bir değeri temsil eder. Gerçekten de, astrositlerin BBB fizyolojisindeki önemi göz önüne alındığında, bu üçüncü hücre tipi, BBB içindeki hücre-hücre iletişiminin daha iyi anlaşılmasını sağlar. Ayrıca, üçlü hücre kültürü sistemi, astrositlerin önemli bir rol oynadığı inme gibi patolojik durumlarda da incelenebilir33,34,35. Ek olarak, kesici uç filtresinin her iki tarafındaki BLEC’lerin / perisitlerin tasarımı, beyin kanseri23 gibi patolojik durumları taklit etmek için diğer hücre tiplerine kolayca yerleştirilebilir.
Kesici uç filtresinin gözenek boyutu, BBB genelinde hücre geçişi gibi bazı deneylerle sınırlamalar getirebilir. Bununla birlikte, modelin daha büyük bir gözenek boyutuna sahip gelişimi, BBB36’yı taklit etmek için fizyolojik olarak ilgili olmayan çoklu katmanların değil, fizyolojik bir tek katmanlı ECs oluşumunun sağlanmasını sağlamak için protokolün uyarlanmasını gerektirir.
Modelin uygulanabilirliği, çok hücreli bir sistem kullanarak taşıma deneyi yapma olasılığını sergileyen NG’lerin taşıma deneyi kullanılarak gösterilmiştir. Bununla birlikte, taşıma deneyi için bir kontrol bileşiğine veya molekülüne sahip olmanın zorluklarının farkında olunmalı, her nanoyapı benzersiz bir özellik kümesi (moleküler ağırlık, yük, şekil, fiziksel özellikler, protein korona oluşumu) sergilediğinden, NG’lerle karşılaştırılabilir özellikleri paylaşmalıdır.
Modelin bir sınırlaması, EC’lerin farklılaşmasını ve TJ proteinlerinin ekspresyonunu etkilediği gösterilen kesme gerilmesinin olmamasıdır37. Bununla birlikte, beyin kılcal damarını taklit eden akışkan bir sistem geliştirmek, çoklu hücre sistemine belirli bir cihaz gerektiren akışkan bir parça eklemenin karmaşıklığı göz önüne alındığında zordur. Dahası, belirli bir cihaz genellikle ticari olarak temin edilemez ve birçok kopyaya izin vermez, böylece akışkan sistemleri yüksek verimli kullanım için daha az uyarlanmış hale getirir.
Özetle, insan hücrelerinden oluşan bu üçlü kültür sistemi, BBB’nin mimarisini in vitro olarak yeniden üretir. Bileşiklerin kapsamlı bir şekilde taranması için kullanılabilecek birçok kesici ucun üretilmesini sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı tarafından, Marie Skłodowska-Curie Yenilikçi Eğitim Ağı (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi) olan NANOSTEM projesinin bir parçası olarak, 764958 No’lu hibe anlaşması kapsamında verilmektedir. Bu çalışma ‘Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais’ (Clémence Deligne Bursu), “Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l’Enfant et de l’adolescent” (SFCE), “l’étoile de Martin” Derneği ve Dernek”Cassandra contre la leucémie” tarafından verilmektedir.
Cell Culture | |||
Astocyte Medium (AM) | ScienCell | 1801 | |
Astrocyte Growth Supplement | ScienCell | 1852 | Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set. |
Cell culture dish 100 mm | Corning | 430293 | 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting |
Cell culture dish 150 mm | Corning | 430599 | The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model. |
Collagen I | Corning | 354236 | Rat tail |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 31600-083 | Powder |
Endothelial Cell Growth Supplement | ScienCell | 1051 | Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set. |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fetal Calf Serum | Sigma | F7524 | |
Gelatin | Sigma | G2500 | 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF |
Gentamicin | BiochromA6 | A-2712 | |
Glucose | Sigma | G6152 | Powder |
Glutamine | Merck | 1002891000 | |
Human Brain Cortex Astrocytes | ScienCell | 1800-SC | |
Malassez cell counting chamber | vWR | HECH40453702 | The count was performed manually. |
Matrigel | Corning | 354230 | Extracellular matrix-based hydrogel |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 0503 | Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets. |
Poly-L-lysine | ScienCell | 0413 | |
Steritop | Millipore System | SCGPT0SRE | 0.22 µm pore size |
Transwell insert | Corning | 3401 | 0.4 µm pore polycarbonate filter |
Trypsin/EDTA neutralization solution | ScienCell | 0113 | |
Trypsin/EDTA solution | ScienCell | 0103 | |
Immunocytochemistry | |||
SEA BLOCK blocking buffer | ThermoScientific | 37527 | |
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody | Thermofisher | A11031 | Dilution 1:500 |
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody | Thermofisher | A11036 | Dilution 1:500 |
Anti-Claudin-5 primary antibody | InVitrogen | 34-1600 | Dilution 1:100 |
Anti-Desmin primary antibody | Abcam | ab6322 | Dilution 1:200 |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody | Dako | Z0334 | Dilution 1:500 |
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody | Abcam | ab51090 | Dilution 1:200 |
Anti-VE-cadherin primary antibody | Abcam | ab207732 | Dilution 1:200 |
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody | InVitrogen | 61-7300 | Dilution 1:200 |
Normal Goat Serum | Sigma | G6767 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36962 | |
Gene expression | |||
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit | Macherey-Nagel | 740,933,250 | |
96 multiplate well | Biorad | HSP9601 | |
iSCRIPT | Biorad | 1708841 | |
Sealer sheet | Biorad | MSB1001 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | Biorad | 172-5201 | |
Protein expression | |||
2x Laemli Sample Buffer | Biorad | 161-0737 | Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay. |
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody | Abcam | ab207732 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Claudin-5 primary antibody | Abcam | ab15106 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody | Millipore | 07-1401 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Mouse secondary antibody | Dako | P0447 | Dilution 1:5000 in TBS-Tween |
Anti-P-glycoprotein primary antibody | Genetex | GTX23364 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT |
Anti-Rabbit secondary antibody | Dako | P0448 | Dilution 1:8000 in TBS-Tween |
Anti-Transferrin Receptor primary antibody | Abcam | ab84036 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Zona occludens-1 primary antibody | Abcam | ab216880 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Criterion TGX Gel | Biorad | 5678083 | |
ECL Prime Solution | Amersham | RPN2236 | Revelation solution to keep in the dark |
Phospatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
Phospatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
Protease Inhibitor | Sigma | P8340 | |
Protein Standards | Biorad | 161-0373 | Molecular weight markers |
RIPA 10x | Millipore | 20-188 | |
TBS 10x | Biorad | 1706435 | |
TRIS-Glycine | Biorad | 1610771 | |
Tween | Biorad | 1706531 | |
BBB integrity assay | |||
Sodium Fluorescein | Ampresco | 0681 | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Elacridar | Sigma | SML0486 | GF120918 |
FITC-Dextran 20 kDa | Sigma | FD-20S | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Rhodamine 123 | Sigma | R8004 | λex= 501 nm; λem= 538 nm |
SynergyTM H1 | BioTek Instruments | Fluorescent multiplate reader | |
Nanogel Transport | |||
Syringe | Terumo | SS+01T1 | 1 mL syringe |
Filter | FisherScientific | 15161499 | 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter |
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels | The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. |