Questo protocollo descrive un metodo per stabilire un modello umano di barriera emato-encefalica (BBB) in vitro . Le cellule endoteliali e i periciti sono seminati su ciascun lato di un filtro inserto (compartimento sanguigno) e gli astrociti sono seminati nel pozzetto inferiore (compartimento cerebrale). Il modello caratterizzato è stato utilizzato per esperimenti di trasporto di nanoparticelle.
La somministrazione di farmaci al cervello rimane una sfida a causa delle proprietà altamente specifiche e restrittive della barriera emato-encefalica (BBB), che controlla e limita l’accesso al parenchima cerebrale. Tuttavia, con lo sviluppo delle nanotecnologie, sono stati sviluppati grandi pannelli di nuovi nanomateriali per migliorare la somministrazione di farmaci, evidenziando la necessità di microsistemi in vitro affidabili per prevedere la penetrazione cerebrale nell’ambito dei saggi preclinici. Ecco un metodo semplice per impostare un sistema microfisiologico per modellare la BBB utilizzando esclusivamente cellule umane. Nella sua configurazione, il modello consiste in una tripla coltura che include cellule endoteliali simili al cervello (BLEC), periciti e astrociti, i tre principali attori cellulari della BEE necessari per indurre e regolare le proprietà della BEE in modo più fisiologico senza la necessità di stringere i composti. Il modello sviluppato in un formato a piastra a 12 pozzetti, pronto dopo 6 giorni di tripla coltura, è caratterizzato da proprietà fisiche, espressioni geniche e proteiche e utilizzato per la misurazione del trasporto di nanogel polimerici. Il modello può essere utilizzato per una vasta gamma di esperimenti in condizioni sane e patologiche e rappresenta un valido strumento per valutazioni precliniche del trasporto di molecole e particelle, nonché del traffico intercellulare e intracellulare.
La BBB, localizzata a livello delle cellule endoteliali capillari cerebrali (ECs), controlla e regola l’accesso al parenchima cerebrale, che è cruciale per mantenere l’omeostasi cerebrale e la funzione delle cellule neurali 1,2. Tuttavia, nel caso della patologia cerebrale, la mancanza di accesso al parenchima cerebrale rappresenta un vero ostacolo allo sviluppo di strategie terapeutiche.
Le EC della BBB possiedono un complesso insieme di proprietà, tra cui proteine a giunzione stretta (TJ), che sigillano lo spazio intercellulare, associate a un sistema di pompe di eflusso, trasportatori specifici e recettori, che controllano la via transcellulare 1,2,3. Inoltre, tutte queste proprietà sono indotte e mantenute, grazie alle comunicazioni con i periciti incorporati nella membrana basale della BEE EC e gli astrociti, le cui estremità dei piedi circondano i capillari cerebrali 1,2,3. Quindi, studiare la BBB in vitro è una sfida considerando la complessità della sua architettura e le comunicazioni tra i diversi tipi di cellule che costituiscono l’unità neurovascolare (NVU)2. Inoltre, i diversi tipi di cellule sono cruciali per l’induzione e il mantenimento delle proprietà della BEE e di conseguenza influenzano la previsione dell’incrocio attraverso la BBB. Diverse strategie per la somministrazione di farmaci al cervello sono già state testate utilizzando un ampio pannello di tattiche per aggirare le proprietà limitate della BBB4. Più recentemente, con il progresso delle nanotecnologie, vengono sviluppati nuovi materiali per applicazioni come vettori di farmaci 5,6. Oltre al loro carico più elevato, alla ridotta tossicità e all’aumento della biodisponibilità dei farmaci, questi nuovi nanomateriali possono essere funzionalizzati per una strategia di cavallo di per attraversare la BEE e colpire specificamente le cellule nel parenchima 5,6. Tra i diversi tipi di nanomateriali valutati, i nanogel hanno attirato una notevole attenzione, principalmente grazie alle loro proprietà colloidali e alla capacità di adattare la struttura chimica per introdurre proprietà sensibili agli stimoli 7,8,9,10,11,12,13,14,15.
I modelli in vitro sono ora sviluppati per studi preclinici che utilizzano cellule umane per prevedere la penetrazione cerebrale dei farmaci16. Sono disponibili diverse impostazioni di questi modelli, dai monostrati di EC cerebrali ai sistemi cellulari multipli16. Considerando l’importanza delle cellule NVU nell’induzione e nel mantenimento della BEE e la risposta coordinata all’ambiente patologico, i modelli in vitro di BBB devono considerare tutti questi protagonisti per migliorare la rilevanza della previsione 2,17.
Il metodo attuale descrive la creazione di un modello in vitro di tripla coltura della BBB umana, che è completamente sviluppato con cellule umane per studiare specifici meccanismi cellulari e molecolari umani. Per essere fisiologicamente rilevante, il modello è costituito dai tre principali attori cellulari della BEE (ECs, periciti e astrociti) necessari per indurre e mantenere le proprietà della BEE, senza l’uso di composti di serraggio e mostrando un insieme di proprietà richieste per essere considerato come un modello in vitro di BBB16,18. Il modello è impostato in una configurazione che delimita il compartimento sanguigno e cerebrale, adatta per studi preclinici sul trasporto di farmaci e particelle per prevedere la penetrazione cerebrale. L’utilità del modello è illustrata misurando il trasporto di nanogel polimerici.
Il trattamento delle malattie cerebrali rimane una sfida considerando la difficoltà dei farmaci di superare la BBB per raggiungere i loro obiettivi cellulari e molecolari nel parenchima cerebrale.
Lo sviluppo di farmaci per le malattie cerebrali mostra attualmente un basso tasso di successo poiché la maggior parte dei farmaci che mostrano risultati promettenti nei modelli preclinici non hanno mostrato alcun beneficio quando utilizzati in clinica. Seguendo la “regola delle 3R”, che mira a ridurre il numero di animali utilizzati per la sperimentazione, vengono sviluppati modelli in vitro della BBB per studiare le patologie cerebrali e prevedere la penetrazione cerebrale dei farmaci29. I modelli in vitro di BBB sono stati sviluppati principalmente utilizzando cellule animali e sono diventati più sofisticati per migliorare la rilevanza dei risultati ottenuti16. Uno dei progressi significativi nell’uso delle cellule umane, che porta innegabili nuove intuizioni e maggiore specificità, a livello cellulare e molecolare, per studiare i meccanismi delle malattie umane16. Tuttavia, lo sviluppo di modelli pertinenti richiede di considerare il miglioramento delle impostazioni del modello in vitro della BBB e le conoscenze che ne derivano, grazie ai modelli animali. Quindi, è necessario considerare la complessità dell’architettura della BEE e l’importanza delle comunicazioni cellula-cellula per studiare la BBB in condizioni fisiologiche e patologiche30.
Il protocollo qui presentato descrive un metodo per impostare un modello umano completo di BBB in vitro comprendente i tre principali tipi di cellule della BEE, senza limitazioni di accesso al tessuto cerebrale. Come sistema a cellule multiple, l’induzione e il mantenimento delle proprietà della BEE, senza l’uso artificiale di composti di serraggio, ma invece indotti dalle comunicazioni cellula-cellula, sono più fisiologicamente rilevanti e in linea con l’induzione in vivo delle proprietà della BEE31. Pertanto, il rispetto della cronologia del protocollo è di primaria importanza per il successo del protocollo. Inoltre, i tempi di incubazione durante l’impostazione della tripla coltura e una volta assemblati i tre tipi di cellule rappresentano i principali passaggi critici del protocollo.
Le proprietà BBB nelle EC sono indotte dalla co-coltura con periciti, come descritto per il modello di co-coltura24. Quindi, la coltura di periciti sul retro del filtro inserto è il punto più critico e richiede di seguire rigorosamente il protocollo a rischio di non avere abbastanza periciti per l’induzione delle proprietà della BEE. Prima di tutto, durante la procedura di rivestimento e anche la semina cellulare, bisogna fare attenzione a non avere il coperchio della capsula di Petri a contatto con il rivestimento e anche il mezzo una volta che le cellule sono seminate per garantire un buon rivestimento del filtro e non perdere cellule (passaggi 2.2.1 e 2.2.4). Inoltre, una volta seminati i periciti, è essenziale attendere il tempo indicato per l’attacco dei periciti (punto 2.2.4) prima di invertire il filtro di inserimento per il rivestimento e la semina delle EC sull’altro lato (punti 2.2.5 e 2.3). Una volta seminato, sono necessari sei giorni per indurre le proprietà della BEE attraverso le comunicazioni cellula-cellula (fase 2.4).
Il modello è convalidato in termini di permeabilità limitata (associata all’impostazione delle giunzioni strette) poiché le EC del modello di tripla coltura mostrano valori di permeabilità ai marcatori di integrità della BEE simili al modello di co-coltura convalidato e misurati anche in modelli animali o umani convalidati 16,27,32. Inoltre, la validazione di un modello in vitro di BBB richiede, oltre alla limitata permeabilità, la reattività ad altri tipi cellulari della NVU e l’espressione di recettori e trasportatori funzionali16. Inoltre, il modello è riproducibile e produce più filtri e pozzetti per eseguire numerose analisi (espressione genica e proteica, colorazione fluorescente, test di tossicità) su ciascun tipo di cellula separatamente senza richiedere un metodo di selezione cellulare.
Il modello è stato sviluppato utilizzando un filtro di dimensioni dei pori da 0,4 μm per avere un tipo di cella su ciascun lato del filtro inserto. Il sistema di filtraggio a inserto ha permesso lo studio delle comunicazioni cellula-cellula in condizioni fisiologiche trasferendole su astrociti ben contenenti. La presenza di astrociti nel sistema rappresenta un valore aggiunto rispetto alla co-coltura iniziale in vitro modello24. Infatti, considerando l’importanza degli astrociti nella fisiologia della BEE, questo terzo tipo di cellula consente un’ulteriore comprensione delle comunicazioni cellula-cellula all’interno della BBB. Inoltre, il sistema di coltura a tripla cellula può essere studiato anche in condizioni patologiche come l’ictus, in cui gli astrociti svolgono un ruolo essenziale33,34,35. Inoltre, il design di BLEC / periciti su entrambi i lati del filtro inserto può essere facilmente posizionato su altri tipi di cellule per imitare condizioni patologiche come il cancro al cervello23.
La dimensione dei pori del filtro dell’inserto può portare limitazioni con alcuni esperimenti, come la trasmigrazione cellulare attraverso la BBB. Tuttavia, lo sviluppo del modello con una dimensione dei pori più grande richiede l’adattamento del protocollo per garantire la formazione di un monostrato fisiologico di EC e non di strati multipli, che non è fisiologicamente rilevante per imitare la BBB36.
L’applicabilità del modello è stata dimostrata utilizzando l’esperimento di trasporto NGs che mostra la possibilità di fare esperimenti di trasporto utilizzando un sistema multicellulare. Tuttavia, si dovrebbe essere consapevoli delle difficoltà nell’avere un composto o una molecola di controllo per l’esperimento di trasporto, condividendo proprietà comparabili con i NG poiché ogni nanostruttura presenta un insieme unico di proprietà (peso molecolare, carica, forma, proprietà fisiche, formazione di corona proteiche).
Una limitazione del modello è l’assenza di sforzo di taglio, che ha dimostrato di influenzare la differenziazione delle EC e l’espressione delle proteine TJ37. Tuttavia, lo sviluppo di un sistema fluidico che imita il capillare cerebrale è impegnativo considerando la complessità dell’aggiunta di una parte fluidica, che richiede un dispositivo specifico, in un sistema a più cellule. Inoltre, il particolare dispositivo di solito non è disponibile in commercio e non consente molte repliche, rendendo così i sistemi fluidici meno adatti per l’uso ad alta produttività.
In sintesi, questo triplo sistema di coltura costituito da cellule umane riproduce in vitro l’architettura della BBB. Consente la generazione di molti inserti che possono essere utilizzati per uno screening approfondito dei composti.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è concesso dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione Europea nell’ambito dell’accordo di sovvenzione n. 764958, nell’ambito del progetto NANOSTEM, una rete di formazione innovativa Marie Skłodowska-Curie (ITN) (Fellowship Eleonora Rizzi). Questo studio è finanziato dal «Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais» (Fellowship to Clémence Deligne), dalla “Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l’Enfant et de l’adolescent” (SFCE), dall’Association “l’étoile de Martin” e dall’Association “Cassandra contre la leucémie”.
Cell Culture | |||
Astocyte Medium (AM) | ScienCell | 1801 | |
Astrocyte Growth Supplement | ScienCell | 1852 | Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set. |
Cell culture dish 100 mm | Corning | 430293 | 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting |
Cell culture dish 150 mm | Corning | 430599 | The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model. |
Collagen I | Corning | 354236 | Rat tail |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 31600-083 | Powder |
Endothelial Cell Growth Supplement | ScienCell | 1051 | Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set. |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fetal Calf Serum | Sigma | F7524 | |
Gelatin | Sigma | G2500 | 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF |
Gentamicin | BiochromA6 | A-2712 | |
Glucose | Sigma | G6152 | Powder |
Glutamine | Merck | 1002891000 | |
Human Brain Cortex Astrocytes | ScienCell | 1800-SC | |
Malassez cell counting chamber | vWR | HECH40453702 | The count was performed manually. |
Matrigel | Corning | 354230 | Extracellular matrix-based hydrogel |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 0503 | Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets. |
Poly-L-lysine | ScienCell | 0413 | |
Steritop | Millipore System | SCGPT0SRE | 0.22 µm pore size |
Transwell insert | Corning | 3401 | 0.4 µm pore polycarbonate filter |
Trypsin/EDTA neutralization solution | ScienCell | 0113 | |
Trypsin/EDTA solution | ScienCell | 0103 | |
Immunocytochemistry | |||
SEA BLOCK blocking buffer | ThermoScientific | 37527 | |
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody | Thermofisher | A11031 | Dilution 1:500 |
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody | Thermofisher | A11036 | Dilution 1:500 |
Anti-Claudin-5 primary antibody | InVitrogen | 34-1600 | Dilution 1:100 |
Anti-Desmin primary antibody | Abcam | ab6322 | Dilution 1:200 |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody | Dako | Z0334 | Dilution 1:500 |
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody | Abcam | ab51090 | Dilution 1:200 |
Anti-VE-cadherin primary antibody | Abcam | ab207732 | Dilution 1:200 |
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody | InVitrogen | 61-7300 | Dilution 1:200 |
Normal Goat Serum | Sigma | G6767 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36962 | |
Gene expression | |||
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit | Macherey-Nagel | 740,933,250 | |
96 multiplate well | Biorad | HSP9601 | |
iSCRIPT | Biorad | 1708841 | |
Sealer sheet | Biorad | MSB1001 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | Biorad | 172-5201 | |
Protein expression | |||
2x Laemli Sample Buffer | Biorad | 161-0737 | Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay. |
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody | Abcam | ab207732 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Claudin-5 primary antibody | Abcam | ab15106 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody | Millipore | 07-1401 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Mouse secondary antibody | Dako | P0447 | Dilution 1:5000 in TBS-Tween |
Anti-P-glycoprotein primary antibody | Genetex | GTX23364 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT |
Anti-Rabbit secondary antibody | Dako | P0448 | Dilution 1:8000 in TBS-Tween |
Anti-Transferrin Receptor primary antibody | Abcam | ab84036 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Zona occludens-1 primary antibody | Abcam | ab216880 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Criterion TGX Gel | Biorad | 5678083 | |
ECL Prime Solution | Amersham | RPN2236 | Revelation solution to keep in the dark |
Phospatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
Phospatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
Protease Inhibitor | Sigma | P8340 | |
Protein Standards | Biorad | 161-0373 | Molecular weight markers |
RIPA 10x | Millipore | 20-188 | |
TBS 10x | Biorad | 1706435 | |
TRIS-Glycine | Biorad | 1610771 | |
Tween | Biorad | 1706531 | |
BBB integrity assay | |||
Sodium Fluorescein | Ampresco | 0681 | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Elacridar | Sigma | SML0486 | GF120918 |
FITC-Dextran 20 kDa | Sigma | FD-20S | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Rhodamine 123 | Sigma | R8004 | λex= 501 nm; λem= 538 nm |
SynergyTM H1 | BioTek Instruments | Fluorescent multiplate reader | |
Nanogel Transport | |||
Syringe | Terumo | SS+01T1 | 1 mL syringe |
Filter | FisherScientific | 15161499 | 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter |
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels | The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. |