Este protocolo descreve um método para estabelecer um modelo in vitro de barreira hematoencefálica humana (BBB). As células endoteliais e os pericitos são semeados em cada lado de um filtro de inserção (compartimento sanguíneo), e os astrócitos são semeados no poço inferior (compartimento cerebral). O modelo caracterizado foi utilizado para experimentos de transporte de nanopartículas.
A entrega de drogas ao cérebro continua a ser um desafio devido às propriedades altamente específicas e restritivas da barreira hematoencefálica (BBB), que controla e restringe o acesso ao parênquima cerebral. No entanto, com o desenvolvimento das nanotecnologias, grandes painéis de novos nanomateriais foram desenvolvidos para melhorar a entrega de medicamentos, destacando a necessidade de microssistemas in vitro confiáveis para prever a penetração cerebral no quadro de ensaios pré-clínicos. Aqui está um método simples para configurar um sistema microfisiológico para modelar o BBB usando apenas células humanas. Em sua configuração, o modelo consiste em uma cultura tripla, incluindo células endoteliais semelhantes ao cérebro (BLECs), pericitos e astrócitos, os três principais atores celulares BBB necessários para induzir e regular as propriedades do BBB de maneira mais fisiológica, sem a necessidade de compostos de aperto. O modelo desenvolvido em formato de placa de 12 poços, pronto após 6 dias de tripla cultura, caracteriza-se em propriedades físicas, expressões gênicas e proteicas e utilizado para a medição do transporte de nanogel polimérico. O modelo pode ser usado para uma extensa gama de experimentos em condições saudáveis e patológicas e representa uma ferramenta valiosa para avaliações pré-clínicas do transporte de moléculas e partículas, bem como tráfico inter e intracelular.
O BBB, localizado ao nível das células endoteliais capilares cerebrais (CE), controla e regula o acesso ao parênquima cerebral, crucial para a manutenção da homeostase cerebral e da função das células neurais 1,2. No entanto, no caso da patologia cerebral, a falta de acesso ao parênquima cerebral representa um obstáculo real para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas.
As CEs BBB possuem um conjunto complexo de propriedades, incluindo proteínas de junção apertada (TJ), que selam o espaço intercelular, associadas a um sistema de bombas de efluxo, transportadores específicos e receptores, que controlam a via transcelular 1,2,3. Além disso, todas essas propriedades são induzidas e mantidas, graças às comunicações com os pericitos embutidos na membrana basal BBB EC e os astrócitos, cujas extremidades dos pés circundam os capilares cerebrais 1,2,3. Assim, estudar o BBB in vitro é um desafio considerando a complexidade de sua arquitetura e as comunicações entre os diferentes tipos celulares que constituem a unidade neurovascular (UVN)2. Além disso, os diferentes tipos de células são cruciais para a indução e manutenção das propriedades do BBB e, consequentemente, impactam a previsão do cruzamento através do BBB. Diferentes estratégias para a entrega de medicamentos ao cérebro já foram testadas usando um grande painel de táticas para contornar as propriedades restritas do BBB4. Mais recentemente, com o avanço das nanotecnologias, novos materiais estão sendo desenvolvidos para aplicações como portadores de fármacos 5,6. Além de sua maior carga, toxicidade reduzida e aumento da biodisponibilidade dos fármacos, esses novos nanomateriais podem ser funcionalizados para uma estratégia de cavalo de Tróia para atravessar o BBB e atingir especificamente as células do parênquima 5,6. Dentre os diferentes tipos de nanomateriais avaliados, os nanogéis têm atraído considerável atenção, principalmente devido às suas propriedades coloidais e capacidade de adaptar a estrutura química para introduzir propriedades responsivas a estímulos 7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Modelos in vitro são agora desenvolvidos para estudos pré-clínicos utilizando células humanas para prever a penetração cerebral de fármacos16. Diferentes configurações desses modelos estão disponíveis, desde monocamadas de CEs cerebrais até múltiplos sistemas celulares16. Considerando a importância das células NVU na indução e manutenção do BBB e a resposta coordenada ao ambiente patológico, os modelos BBB in vitro precisam considerar todos esses protagonistas para melhorar a relevância da predição 2,17.
O método atual descreve a criação de um modelo de cultura tripla in vitro do BBB humano, que é totalmente desenvolvido com células humanas para estudar mecanismos moleculares celulares e humanos específicos. Para ser fisiologicamente relevante, o modelo consiste nos três principais atores celulares do BBB (CEs, pericitos e astrócitos) necessários para induzir e manter as propriedades do BBB, sem o uso de compostos de aperto e apresentando um conjunto de propriedades necessárias para ser considerado como um modelo BBB in vitro 16,18. O modelo é configurado em uma configuração que delimita o compartimento sanguíneo e cerebral, adequado para estudos pré-clínicos de transporte de drogas e partículas para prever a penetração cerebral. A utilidade do modelo é ilustrada pela medição do transporte de nanogéis poliméricos.
O tratamento de doenças cerebrais continua a ser um desafio, considerando a dificuldade das drogas para o obstáculo sobre o BBB para atingir seus alvos celulares e moleculares no parênquima cerebral.
O desenvolvimento de medicamentos para doenças cerebrais atualmente exibe uma baixa taxa de sucesso, uma vez que a maioria dos medicamentos que exibem resultados promissores em modelos pré-clínicos não mostrou nenhum benefício quando usado na clínica. Seguindo a “regra dos 3R”, que visa reduzir o número de animais utilizados para experimentação, modelos in vitro do BBB são desenvolvidos para estudar patologias cerebrais e predizer a penetração cerebral de fármacos29. Modelos in vitro de BBB têm sido desenvolvidos principalmente utilizando células animais e têm se tornado mais sofisticados para melhorar a relevância dos resultados obtidos16. Um dos avanços significativos no uso de células humanas, que traz inegável nova visão e mais especificidade, nos níveis celular e molecular, para estudar os mecanismos da doença humana16. No entanto, o desenvolvimento de modelos relevantes requer considerar a melhoria das configurações do modelo BBB in vitro e o conhecimento surgido, graças aos modelos animais. Assim, é preciso considerar a complexidade da arquitetura BBB e a importância das comunicações célula-célula para o estudo do BBB em condições fisiológicas e patológicas30.
O protocolo aqui apresentado descreve um método para a criação de um modelo completo de BBB humano in vitro compreendendo os três principais tipos celulares do BBB, sem limitação de acesso ao tecido cerebral. Como um sistema celular múltiplo, a indução e a manutenção das propriedades do BBB, sem o uso artificial de compostos de aperto, mas induzidas pelas comunicações célula-célula, é mais fisiologicamente relevante e em consonância com a indução in vivo das propriedades do BBB31. Assim, o respeito à cronologia do protocolo é primordial para o sucesso do protocolo. Além disso, os tempos de incubação durante a configuração da tríplice cultura e uma vez que os três tipos de células são montados representam as principais etapas críticas do protocolo.
As propriedades BBB em CEs são induzidas pela co-cultura com pericitos, conforme descrito para o modelo de co-cultura24. Assim, a cultura de pericitos no verso do filtro de inserção é o ponto mais crítico e requer seguir rigorosamente o protocolo, sob o risco de não haver pericitos suficientes para a indução das propriedades BBB. Em primeiro lugar, durante o procedimento de revestimento e também a semeadura celular, deve-se ter atenção para não ter a cobertura da placa de Petri em contato com o revestimento e também com o meio, uma vez que as células são semeadas para garantir um bom revestimento do filtro e não perder células (etapas 2.2.1 e 2.2.4). Além disso, uma vez semeadas os pericitos, é essencial aguardar o tempo indicado para a fixação dos pericitos (passo 2.2.4) antes de reverter o filtro de inserção para o revestimento e semeadura das CEs do outro lado (passos 2.2.5 e 2.3). Uma vez semeado, são necessários seis dias para induzir as propriedades BBB através de comunicações célula-célula (etapa 2.4).
O modelo é validado em termos de permeabilidade restrita (associada à fixação das junções apertadas), uma vez que as CEs do modelo de cultura tripla apresentam valores de permeabilidade a marcadores de integridade BBB semelhantes ao modelo de cocultura validado e também medidos em modelos animais ou humanos validados 16,27,32. Além disso, a validação de um modelo de BBB in vitro requer, além da permeabilidade restrita, a responsividade a outros tipos celulares da NVU e a expressão de receptores e transportadores funcionais16. Além disso, o modelo é reprodutível e produz vários filtros de inserção e poços para realizar inúmeras análises (expressão gênica e proteica, coloração fluorescente, testes de toxicidade) em cada tipo de célula separadamente, sem a necessidade de um método de classificação celular.
O modelo foi desenvolvido usando um filtro de tamanho de poro de 0,4 μm para ter um tipo de célula em cada lado do filtro de inserção. O sistema de filtro de inserção permitiu o estudo das comunicações célula-célula em condições fisiológicas, transferindo-as sobre astrócitos bem contidos. A presença de astrócitos no sistema representa um valor positivo em relação ao modelo inicial de cocultura in vitro 24. De fato, considerando a importância dos astrócitos na fisiologia do BBB, esse terceiro tipo de célula permite uma maior compreensão das comunicações célula-célula dentro do BBB. Além disso, o sistema de cultura de células triplas também pode ser estudado em condições patológicas como o acidente vascular encefálico, em que os astrócitos desempenham um papel essencial 33,34,35. Além disso, o desenho de BLECs/pericitos em ambos os lados do filtro de inserção pode ser facilmente colocado em outros tipos de células para imitar condições patológicas, como câncer cerebral23.
O tamanho dos poros do filtro de inserção pode trazer limitações com alguns experimentos, como a transmigração celular através do BBB. No entanto, o desenvolvimento do modelo com maior tamanho de poros requer a adaptação do protocolo para garantir a formação de uma monocamada fisiológica de CEs e não de múltiplas camadas, o que não é fisiologicamente relevante para mimetizar o BBB36.
A aplicabilidade do modelo foi demonstrada usando o experimento de transporte de NGs exibindo a possibilidade de fazer experimento de transporte usando um sistema multicelular. No entanto, deve-se estar ciente das dificuldades em ter um composto ou molécula de controle para o experimento de transporte, compartilhando propriedades comparáveis com NGs, uma vez que cada nanoestrutura exibe um conjunto único de propriedades (peso molecular, carga, forma, propriedades físicas, formação de corona de proteína).
Uma limitação do modelo é a ausência de tensão de cisalhamento, que demonstrou influenciar a diferenciação das CEs e a expressão das proteínas TJ37. No entanto, o desenvolvimento de um sistema fluídico imitando o capilar cerebral é um desafio, considerando a complexidade de adicionar uma parte fluídica, exigindo um dispositivo específico, em um sistema de múltiplas células. Além disso, o dispositivo em particular geralmente não está disponível comercialmente e não permite muitas replicações, tornando os sistemas fluídicos menos adaptados para uso de alto rendimento.
Em resumo, este sistema de cultura tripla constituído por células humanas reproduz in vitro a arquitetura do BBB. Permite a geração de muitas pastilhas que podem ser usadas para triagem extensiva de compostos.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho é concedido pelo programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do acordo de subvenção n.º 764958, no âmbito do projeto NANOSTEM, uma Rede de Formação Inovadora (ITN) Marie Skłodowska-Curie (Fellowship Eleonora Rizzi). Este estudo é concedido pelo «Conseil régional du Nord-Pas-de-Calais» (Fellowship to Clémence Deligne), pela “Société Française de lutte contre les Cancers et les leucémies de l’Enfant et de l’adolescent” (SFCE), pela Association “l’étoile de Martin” e pela Association “Cassandra contre la leucémie”.
Cell Culture | |||
Astocyte Medium (AM) | ScienCell | 1801 | |
Astrocyte Growth Supplement | ScienCell | 1852 | Astrocyte Growth Supplement is provided in the AM set. |
Cell culture dish 100 mm | Corning | 430293 | 100 mm x 20 mm; dish used for the thawing of ECs and PCs before the triculture setting |
Cell culture dish 150 mm | Corning | 430599 | The height of these dishes (25 mm) allows the seeding of PCs in the reverted insert for the setting of the triculture model. |
Collagen I | Corning | 354236 | Rat tail |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 31600-083 | Powder |
Endothelial Cell Growth Supplement | ScienCell | 1051 | Endothelial Cell Growth Supplement is provided in the ECM set. |
Endothelial Cell Medium (ECM) | ScienCell | 1001 | |
Fetal Calf Serum | Sigma | F7524 | |
Gelatin | Sigma | G2500 | 2% gelatin from porcine skin in PBS-CMF |
Gentamicin | BiochromA6 | A-2712 | |
Glucose | Sigma | G6152 | Powder |
Glutamine | Merck | 1002891000 | |
Human Brain Cortex Astrocytes | ScienCell | 1800-SC | |
Malassez cell counting chamber | vWR | HECH40453702 | The count was performed manually. |
Matrigel | Corning | 354230 | Extracellular matrix-based hydrogel |
Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 0503 | Penicillin/Streptomycin solution is provided in the ECM and AM sets. |
Poly-L-lysine | ScienCell | 0413 | |
Steritop | Millipore System | SCGPT0SRE | 0.22 µm pore size |
Transwell insert | Corning | 3401 | 0.4 µm pore polycarbonate filter |
Trypsin/EDTA neutralization solution | ScienCell | 0113 | |
Trypsin/EDTA solution | ScienCell | 0103 | |
Immunocytochemistry | |||
SEA BLOCK blocking buffer | ThermoScientific | 37527 | |
Alexa Fluor 568 anti-Mouse secondary antibody | Thermofisher | A11031 | Dilution 1:500 |
Alexa Fluor 568 anti-Rabbit secondary antibody | Thermofisher | A11036 | Dilution 1:500 |
Anti-Claudin-5 primary antibody | InVitrogen | 34-1600 | Dilution 1:100 |
Anti-Desmin primary antibody | Abcam | ab6322 | Dilution 1:200 |
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein primary antibody | Dako | Z0334 | Dilution 1:500 |
Anti-Platelet-Derived Growth Factor-β primary antibody | Abcam | ab51090 | Dilution 1:200 |
Anti-VE-cadherin primary antibody | Abcam | ab207732 | Dilution 1:200 |
Anti-Zona Occludens-1 primary antibody | InVitrogen | 61-7300 | Dilution 1:200 |
Normal Goat Serum | Sigma | G6767 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36962 | |
Gene expression | |||
NucleoSpin Rna/Protein Macherey Nagel Kit | Macherey-Nagel | 740,933,250 | |
96 multiplate well | Biorad | HSP9601 | |
iSCRIPT | Biorad | 1708841 | |
Sealer sheet | Biorad | MSB1001 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | Biorad | 172-5201 | |
Protein expression | |||
2x Laemli Sample Buffer | Biorad | 161-0737 | Add 50 µL of bMercaptoetanol to 950 µL of Laemmli Buffer and store at -20°C. Dilute 1:1 with the protein sample for the assay. |
Anti-Breast Cancer Resistance Protein primary antibody | Abcam | ab207732 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Claudin-5 primary antibody | Abcam | ab15106 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Glucose Transporter 1 primary antibody | Millipore | 07-1401 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Mouse secondary antibody | Dako | P0447 | Dilution 1:5000 in TBS-Tween |
Anti-P-glycoprotein primary antibody | Genetex | GTX23364 | Pre-treatment 15 minutes at RT under agitation; dilution 1:400, 3 hours at RT |
Anti-Rabbit secondary antibody | Dako | P0448 | Dilution 1:8000 in TBS-Tween |
Anti-Transferrin Receptor primary antibody | Abcam | ab84036 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Anti-Zona occludens-1 primary antibody | Abcam | ab216880 | Pre-treatment 5 minutes at 95°C; dilution 1:1000, O.N. at 4°C |
Criterion TGX Gel | Biorad | 5678083 | |
ECL Prime Solution | Amersham | RPN2236 | Revelation solution to keep in the dark |
Phospatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 | |
Phospatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 | |
Protease Inhibitor | Sigma | P8340 | |
Protein Standards | Biorad | 161-0373 | Molecular weight markers |
RIPA 10x | Millipore | 20-188 | |
TBS 10x | Biorad | 1706435 | |
TRIS-Glycine | Biorad | 1610771 | |
Tween | Biorad | 1706531 | |
BBB integrity assay | |||
Sodium Fluorescein | Ampresco | 0681 | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Elacridar | Sigma | SML0486 | GF120918 |
FITC-Dextran 20 kDa | Sigma | FD-20S | λex= 490 nm; λem= 525 nm |
Rhodamine 123 | Sigma | R8004 | λex= 501 nm; λem= 538 nm |
SynergyTM H1 | BioTek Instruments | Fluorescent multiplate reader | |
Nanogel Transport | |||
Syringe | Terumo | SS+01T1 | 1 mL syringe |
Filter | FisherScientific | 15161499 | 0.2 µm PTFE membrane filter, 15 mm diameter |
N-Isopropylacrylamide (NIPAM)-based hydrogels | The nanogels (NGs) used in the study are provided by our collaborator in Queen Mary University London, Department of Chemistry. The NGs are covalently tagged with a fluorescent molecule (λex= 477 nm; λem= 540 nm). NGs are freeze dried and shipped as powder, in this state they are stable at room temperature for long period of time. |