概要

שיטות ספקטרופוטומטריות לחקר מטבוליזם גליקוגן אאוקריוטי

Published: August 19, 2021
doi:

概要

טכניקות למדידת הפעילות של אנזימי מפתח של מטבוליזם גליקוגן מוצגות, באמצעות ספקטרופוטומטר פשוט הפועל בטווח הנראה לעין.

Abstract

גליקוגן מסונתז כצורת אחסון של גלוקוז על ידי מגוון רחב של אורגניזמים, החל מחיידקים וכלה בבעלי חיים. המולקולה מורכבת משרשראות ליניאריות של שאריות גלוקוז מקושרות α1,4 עם ענפים המוחדרים באמצעות תוספת של α1,6-linkages. הבנת האופן שבו סינתזה ופירוק של גליקוגן מוסדרים וכיצד גליקוגן משיג את המבנה המסועף האופייני שלו דורשת מחקר של האנזימים של אחסון גליקוגן. עם זאת, השיטות הנפוצות ביותר לחקר פעילויות אנזימים אלה משתמשות בדרך כלל בריאגנטים או בטכניקות שאינן זמינות לכל החוקרים. במאמר זה נדון בסוללה של הליכים שהם פשוטים מבחינה טכנית, חסכוניים ועדיין מסוגלים לספק תובנות חשובות לגבי השליטה באחסון גליקוגן. הטכניקות דורשות גישה לספקטרופוטומטר, הפועל בטווח של 330 עד 800 ננומטר, ומתוארות בהנחה שהמשתמשים ישתמשו בחלוקי פלסטיק חד פעמיים. עם זאת, ההליכים ניתנים להרחבה בקלות וניתן לשנות אותם לשימוש בקורא microplate, מה שמאפשר ניתוח מקביל מאוד.

Introduction

גליקוגן מופץ באופן נרחב בטבע, כאשר התרכובת נמצאת בחיידקים, פרוטיסטים רבים, פטריות ובעלי חיים. במיקרואורגניזמים, גליקוגן חשוב להישרדות התאים כאשר חומרי המזון מגבילים, ובאורגניזמים גבוהים יותר כמו יונקים, סינתזה ופירוק של גליקוגן משמשים למאגר רמות הגלוקוז בדם 1,2,3. חקר חילוף החומרים של גליקוגן הוא, אם כן, בעל חשיבות לתחומים מגוונים כגון מיקרוביולוגיה ופיזיולוגיה של יונקים. הבנת חילוף החומרים של גליקוגן דורשת לחקור את האנזימים העיקריים של סינתזת גליקוגן (גליקוגן סינתאז ואנזים המסתעף) ופירוק גליקוגן (גליקוגן פוספורילאז ואנזים מסתעף). מבחני תקן הזהב של גליקוגן סינתאז, פוספורילאז, הסתעפות ופירוק פעילויות אנזימים משתמשים באיזוטופים רדיואקטיביים. לדוגמה, גליקוגן סינתאז נמדד בדרך כלל בבדיקה רדיוכימית עצורה על ידי שילוב של גלוקוז מ-UDP-[14 C]גלוקוז (במקרה של אנזימים מן החי והפטריות) או ADP-[14C]גלוקוז (במקרה של אנזימים חיידקיים) לתוך גליקוגן 4,5. באופן דומה, גליקוגן פוספורילאז נמדד בכיוון של סינתזת גליקוגן, בעקבות שילוב גלוקוז מ[14C]גלוקוז-1-פוספט לתוך גליקוגן6. אנזים ההסתעפות נבדק על ידי מדידת יכולתו של אנזים זה לעורר שילוב של [14 C]גלוקוז מגלוקוז-1-פוספט לשרשראות α1,4 מקושרות על ידי גליקוגן פוספורילאז7, ופעילות האנזים המתפרק נקבעת על ידי מעקב אחר יכולתו של האנזים לשלב [14C]גלוקוז בגליקוגן8 . למרות שהם רגישים מאוד, ומאפשרים את השימוש בהם בתמציות תאים גולמיים עם רמות נמוכות של פעילות אנזימים, הסובסטרטים הרדיואקטיביים יקרים וכפופים לדרישות הרגולטוריות הנלוות לשימוש ברדיואיזוטופים. חסמים אלה מציבים את השימוש במבחנים מסוימים מחוץ להישג ידם של עובדים רבים. עם זאת, במשך שנים רבות תואר מגוון מרשים של גישות ספקטרופוטומטריות למדידת אנזימים אלה. באופן כללי, גישות אלה מסתמכות בסופו של דבר על מדידת הייצור או הצריכה של NADH/NADPH, או על יצירת קומפלקסים צבעוניים בין גליקוגן ליוד. לפיכך, הם פשוטים וניתן לבצע אותם באמצעות ספקטרופוטומטרים פשוטים המצוידים רק במנורות הבזק טונגסטן או קסנון.

בדיקות ספקטרופוטומטריות של גליקוגן סינתאז מסתמכות על מדידת הנוקלאוזיד דיפוספט המשתחרר מתורם נוקלאוטיד הסוכר, כאשר גלוקוז מתווסף לשרשרת הגליקוגןההולכת וגדלה 9,10. הנוהל למדידת פעילות גליקוגן סינתאז המתואר בסעיף 1 לפרוטוקול, להלן, הוא שינוי של זה שתואר על ידי Wayllace et al.11, וסכמת הצימוד מוצגת להלן:

(גלוקוז) n + UPD-גלוקוז → (גלוקוז)n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + פוספונולפירובט → פירובט + ATP

פירובט + NADH + H+ → לקטט + NAD+

גליקוגן סינתאז מוסיף גלוקוז מ-UDP-גלוקוז על גליקוגן. ה-UDP שנוצר בתהליך זה מומר ל-UTP על ידי נוקלאוזיד דיפוספט קינאז (NDP kinase), בתגובה שיוצרת ADP. ה- ADP, בתורו, משמש כמצע לפירובט קינאז, אשר פוספורילטים את ה- ADP באמצעות פוספונולפירובט כתורם פוספט. הפירובט המתקבל מומר ללקטט על ידי האנזים לקטט דהידרוגנאז בתגובה הצורכת NADH. הבדיקה יכולה, אם כן, להתבצע באופן רציף, תוך מעקב אחר הירידה בספיגה ב 340 ננומטר כמו NADH נצרך. הוא מותאם בקלות לשימוש עם אנזימים הדורשים ADP-גלוקוז כתורם גלוקוז. כאן, שלבי הצימוד פשוטים יותר מכיוון שה-ADP המשתחרר על ידי פעולת הגליקוגן סינתאז מופעל ישירות על ידי פירובט קינאז.

קיימים מגוון מבחנים ספקטרופוטומטריים לקביעת פעילות גליקוגן פוספורילאז. בגרסה הקלאסית, האנזים מונע לאחור, בכיוון של סינתזת גליקוגן, כפי שמוצג להלן:

(גלוקוז) n + גלוקוז-1-פוספט → (גלוקוז)n+1 + Pi

במרווחי זמן מתוזמנים מוסרים אליקוטים של תערובת התגובה, וכמות הפוספט המשוחררת מכמתת12,13. בידינו, בדיקה זו הייתה בשימוש מוגבל בשל נוכחותו של פוספט חופשי הניתן למדידה בקלות בתכשירים מסחריים רבים של גלוקוז-1-פוספט, בשילוב עם הריכוזים הגבוהים של גלוקוז-1-פוספט הדרושים לפעולת פוספורילאז. במקום זאת, השתמשנו באופן שגרתי בבדיקה חלופית המודדת את הגלוקוז-1-פוספט המשתחרר כאשר הגליקוגן מתפרק על-ידי זרחן13. נעשה שימוש בסכמת תגובה מצומדת, המומחשת להלן.

(גלוקוז) n + Pi → (גלוקוז)n-1 + גלוקוז-1-פוספט

גלוקוז-1-פוספט → גלוקוז-6-פוספט

גלוקוז-6-פוספט + NADP + → 6-פוספוגלוקונולקטון + NADPH + H+

הגלוקוז-1-פוספט מומר לגלוקוז-6-פוספט על-ידי פוספוגלוקוטאז, והגלוקוז-6-פוספט מתחמצן ל-6-פוספוקונולקטון, עם הפחתה מקבילה של NADP+ ל-NADPH. הנוהל המפורט בסעיף 2 לפרוטוקול, להלן, נגזר משיטות שתוארו על ידי Mendicino et al.14 ו- Schreiber & Bowling 15. הבדיקה יכולה להתבצע בקלות באופן רציף, עם עלייה בספיגה ב 340 ננומטר לאורך זמן, המאפשר את קביעת קצב התגובה.

קביעה ספקטרופוטומטרית של פעילות אנזים מתפרקת מסתמכת על מדידת הגלוקוז המשתחרר על ידי פעולת האנזים על גבול הזרחן דקסטרין16. תרכובת זו מיוצרת על ידי טיפול ממצה בגליקוגן פוספורילאז. מאחר שפעולת הגליקוגן פוספורילאז עוצרת 4 שאריות גלוקוז מנקודת ענף α1,6, דקסטרין הגבול מכיל גליקוגן, שהשרשראות החיצוניות שלו קוצרו ל~4 שאריות גלוקוז. הכנת דקסטרין גבול הפוספורילאז מתוארת כאן, באמצעות הליך הנגזר מאלו שפותחו על ידי Taylor et al.17 ו- Makino & Omichi 18.

פירוק הוא תהליך בן שני שלבים. פעילות 4-α-glucanotransferase של אנזים הפירוק הדו-כיווני מעבירה תחילה שלוש שאריות גלוקוז מנקודת הענף לקצה הלא-מצמצם של שרשרת גלוקוז סמוכה α1,4 המקושרת. שאריות הגלוקוז הבודדות המקושרות α1,6 שנותרו בנקודת הענף עוברות הידרוליזה על-ידי פעילות α1,6-גלוקוזידאז19. הבדיקה מבוצעת בדרך כלל בצורה עצורה, כאשר הגלוקוז משתחרר לאחר זמן נתון (או סדרה של פעמים) נמדד במבחן אנזים מצומד כפי שמוצג להלן:

(גלוקוז) n → (גלוקוז)n-1 + גלוקוז

גלוקוז + ATP → גלוקוז-6-פוספט + ADP

גלוקוז-6-פוספט + NADP + → 6-פוספוגלוקונולקטון + NADPH + H+

קביעת NADPH המיוצר נותן מדד לייצור גלוקוז. הנוהל המתואר בסעיף 3 לפרוטוקול, להלן, מבוסס על הליך שתואר על ידי Nelson et al.16. כמו השיטות האחרות המסתמכות על צריכה או ייצור של NADH/NADPH, הבדיקה רגישה למדי. עם זאת, נוכחות של עמילאזות או גלוקוזידאזות אחרות, שיכולות גם לשחרר גלוקוז חופשי מפוספורילאז המגבילות את הדקסטרין, תגרום להפרעות משמעותיות (ראו דיון).

הקביעה הצבעונית של פעילות אנזימי הסתעפות מסתמכת על העובדה ששרשראות α1,4 של גלוקוז מאמצות מבנים סליליים הנקשרים ליוד, ויוצרים קומפלקסים צבעוניים20. צבע הקומפלקס שנוצר תלוי באורך השרשראות המקושרות α1,4. לפיכך, עמילוז, המורכב משרשראות ארוכות, ברובן לא מסותתות, של גלוקוז α1,4 המקושר, יוצר קומפלקס כחול עמוק עם יוד. לעומת זאת, גליקוגנים, שהשרשראות החיצוניות שלהם הן בדרך כלל בסדר גודל של 6 עד 8 שאריות גלוקוז בלבד, יוצרים קומפלקסים כתומים-אדומים. אם תמיסה של עמילוז מודגרת באנזים מסתעף, הכנסת הענפים לתוך העמילוז גורמת ליצירת שרשראות סוכר קצרות יותר α1,4 המקושרות זו לזו. לפיכך, מקסימום הספיגה של קומפלקסי העמילוז/יוד נע לעבר אורכי גל קצרים יותר. ההליך הנדון כאן נגזר מזה שפורט על ידי Boyer & Preiss21 ופעילות האנזים המסתעף מכמתת כהפחתה בספיגת קומפלקס העמילוז/יוד ב-660 ננומטר לאורך זמן.

כפי שניתן לראות בקלות מהדיון לעיל, העובדה שצבעי הקומפלקסים הנוצרים בין שרשראות יוד ו-α1,4-גלוקוז משתנים עם אורך השרשרת פירושה שספקטרום הספיגה של קומפלקסים של גליקוגן/יוד צריך להשתנות עם מידת הסתעפות הגליקוגן. זה אכן המקרה, וגליקוגנים/גליקוגנים פחות מסועפים עם שרשראות חיצוניות ארוכות יותר בולעים אור באורך גל ארוך יותר מאשר גליקוגנים מסועפים יותר / בעלי שרשראות חיצוניות קצרות יותר. לפיכך, ניתן להשתמש בתגובת צביעת היוד כדי לקבל נתונים מהירים ואיכותיים על מידת הסתעפות הגליקוגן22. הצבע הכתום-חום נוצר כאשר קומפלקסים גליקוגן עם יוד אינו אינטנסיבי במיוחד. עם זאת, ניתן לשפר את התפתחות הצבע על ידי הכללת תמיסת קלציום כלוריד רוויה22. זה מגביר את הרגישות של השיטה פי 10 ומאפשר ניתוח מוכן של כמויות מיקרוגרם של גליקוגן. הבדיקה לקביעת ההסתעפות המתוארת בסעיף 4 לפרוטוקול, להלן, מותאמת מתוך נוהל שפותח על ידי קריסמן22. הוא מתבצע פשוט על ידי שילוב דגימת הגליקוגן עם תמיסת יוד וסידן כלורי בקובט ואיסוף ספקטרום הספיגה מ 330 ננומטר ל 800 ננומטר. מקסימום הספיגה משתנה לכיוון אורכי גל ארוכים יותר ככל שמידת ההסתעפות יורדת.

באופן קולקטיבי, השיטות המתוארות כאן מספקות אמצעים פשוטים ואמינים להערכת פעילותם של האנזימים המרכזיים של חילוף החומרים של גליקוגן, ולהשגת נתונים איכותיים על היקף הסתעפות הגליקוגן.

Protocol

1. קביעת פעילות גליקוגן סינתאז הכן פתרונות מלאי של ריאגנטים נדרשים כפי שמצוין בטבלה 1 (לפני יום הניסוי). רכיב הנחיות נסיעה 50 מ”מ טריס pH 8.0 ממיסים 0.61 גרם של בסיס…

Representative Results

קביעת פעילות גליקוגן סינתאזאיור 1 מראה תוצאות מייצגות של מבחני גליקוגן סינתאז באמצעות אנזימים מטוהרים. בלוח A, לאחר השהיה קלה, חלה ירידה ליניארית בספיגה של 340 ננומטר לאורך זמן לתקופה של כ-12 דקות. קצב השינוי בספיגה באיור 1A היה ~0.12 יחידות ספיגה לדקה. …

Discussion

באופן כללי, היתרונות העיקריים של כל השיטות המוצגות הם העלות הנמוכה, הקלות, המהירות וחוסר ההסתמכות על ציוד מיוחד. החיסרון העיקרי המשותף לכולם הוא רגישות בהשוואה לשיטות זמינות אחרות. קל להעריך את הרגישות של ההליכים הכרוכים בייצור או צריכה של NADH/NADPH. בהתחשב בכך שמקדם ההכחדה של NADH/NADPH הוא 6.22 M-1 <s…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחבר רוצה להודות לקרוליין דיטמר ואנדרו בריטינגהם על תובנותיהם ודיונים מועילים רבים. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מקרן החינוך והמחקר האוסטאופתית של איווה (IOER 03-17-05 ו- 03-20-04).

Materials

Amylopectin (amylose free) from waxy corn Fisher Scientific A0456
Amylose Biosynth Carbosynth YA10257
ATP, disodium salt MilliporeSigma A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt MilliporeSigma G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt MilliporeSigma G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast MilliporeSigma 10127655001
Glycogen, Type II from oyster MilliporeSigma G8751
Hexokinase MilliporeSigma 11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-128 Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt MilliporeSigma N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt MilliporeSigma 43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase MilliporeSigma N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt MilliporeSigma P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle MilliporeSigma P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle MilliporeSigma P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle MilliporeSigma P0294
UDP-glucose, disodium salt MilliporeSigma U4625

参考文献

  1. Wilson, W. A., et al. Regulation of glycogen metabolism in yeast and bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (6), 952-985 (2010).
  2. Ralton, J. E., Sernee, M. F., McConville, M. J. Evolution and function of carbohydrate reserve biosynthesis in parasitic protists. Trends in Parasitology. 1471 (21), 00144-00146 (2021).
  3. Roach, P. J. Glycogen and its metabolism. Current Molecular Medicine. 2 (2), 101-120 (2002).
  4. Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. A rapid filter paper assay for UDPglucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose. Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).
  5. Fox, J., Kawaguchi, K., Greenberg, E., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli B ADPglucose:1,4-alpha-D-glucan 4-alpha-glucosyltransferase. 生化学. 15 (4), 849-857 (1976).
  6. Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases. Analytical Biochemistry. 47 (1), 20-27 (1972).
  7. Brown, D. H., Illingworth, B., Cori, C. F. The mechanism of the de novo synthesis of polysaccharide by phosphorylase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 47 (4), 479-485 (1961).
  8. Nelson, T. E., Larner, J. A rapid micro assay method for amylo-1,6-glucosidase. Analytical Biochemistry. 33 (1), 87-101 (1970).
  9. Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose. Archives of Biochemistry and Biophysics. 81 (2), 508-520 (1959).
  10. Danforth, W. H. Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis. Journal of Biological Chemistry. 240, 588-593 (1965).
  11. Wayllace, N. Z., et al. An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases. Molecular Biology Reports. 39 (1), 585-591 (2012).
  12. Shapiro, B., Wertheimer, E. Phosphorolysis and synthesis of glycogen in animal tissues. Biochemical Journal. 37 (3), 397-403 (1943).
  13. Mezl, V. A., Knox, W. E. Comparison of two methods for the assay of glycogen phosphorylase in tissue homogenates. Enzyme. 13 (4), 197-202 (1972).
  14. Mendicino, J., Afou-Issa, H., Medicus, R., Kratowich, N. Fructose-1, 6-diphosphatase, phosphofructokinase, glycogen synthetase, phosphorylase, and protein kinase from swine kidney. Methods in Enzymology. 42, 375-397 (1975).
  15. Schreiber, W. E., Bowling, S. An automated assay of glycogen phosphorylase in the direction of phosphorolysis. Annals of Clinical Biochemistry. 27, 129-132 (1990).
  16. Nelson, T. E., Kolb, E., Larner, J. Purification and properties of rabbit muscle amylo-1,6-glucosidase-oligo-1,4-1,4-transferase. 生化学. 8 (4), 1419-1428 (1969).
  17. Taylor, C., Cox, A. J., Kernohan, J. C., Cohen, P. Debranching enzyme from rabbit skeletal muscle. Purification, properties and physiological role. European Journal of Biochemistry. 51 (1), 105-115 (1975).
  18. Makino, Y., Omichi, K. Purification of glycogen debranching enzyme from porcine brain: evidence for glycogen catabolism in the brain. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (4), 907-915 (2006).
  19. Lee, E. Y. C., Whelan, W. J., Boyer, P. D. . The Enzymes Vol. 5. , 191-234 (1971).
  20. Yu, X., Houtman, C., Atalla, R. H. The complex of amylose and iodine. Carbohydrate Research. 292, 129-141 (1996).
  21. Boyer, C., Preiss, J. Biosynthesis of bacterial glycogen. Purification and properties of the Escherichia coli b alpha-1,4,-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltansferase. 生化学. 16 (16), 3693-3699 (1977).
  22. Krisman, C. R. A method for the colorimetric estimation of glycogen with iodine. Analytical Biochemistry. 4, 17-23 (1962).
  23. Friedman, D. L., Larner, J. Studies on UDPG-alpha-glucan transglucosylase. iii. Interconversion of two forms of muscle UDPG-alpha-glucan transglucosylase by a phosphorylation-dephosphorylation reaction sequence. 生化学. 2, 669-675 (1963).
  24. Hanashiro, I., Roach, P. J. Mutations of muscle glycogen synthase that disable activation by glucose 6-phosphate. Archives of Biochemistry and Biophysics. 397 (2), 286-292 (2002).
  25. Huang, K. P., Cabib, E. Yeast glycogen synthetase in the glucose 6-phosphate-dependent form. I. Purification and properties. Journal of Biological Chemistry. 249 (12), 3851-3857 (1974).
  26. Pederson, B. A., Cheng, C., Wilson, W. A., Roach, P. J. Regulation of glycogen synthase. Identification of residues involved in regulation by the allosteric ligand glucose-6-P and by phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 275 (36), 27753-27761 (2000).
  27. Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D., Tagliabracci, V. S. Glycogen and its metabolism: some new developments and old themes. Biochemical Journal. 441 (3), 763-787 (2012).
  28. Gosselin, S., Alhussaini, M., Streiff, M. B., Takabayashi, K., Palcic, M. M. A continuous spectrophotometric assay for glycosyltransferases. Analytical Biochemistry. 220 (1), 92-97 (1994).
  29. Wilson, W. A., Pradhan, P., Madhan, N., Gist, G. C., Brittingham, A. Glycogen synthase from the parabasalian parasite Trichomonas vaginalis: An unusual member of the starch/glycogen synthase family. Biochimie. 138, 90-101 (2017).
  30. Krisman, C. R. alpha-1,4-glucan: alpha-1,4-glucan 6-glycosyltransferase from liver. Biochimica et Biophysica Acta. 65, 307-315 (1962).
  31. Sandhya Rani, M. R., Shibanuma, K., Hizukuri, S. The fine structure of oyster glucogen. Carbohydrate Research. 227, 183-194 (1992).
  32. Dittmer, K. E., Pradhan, P., Tompkins, Q. C., Brittingham, A., Wilson, W. A. Cloning and characterization of glycogen branching and debranching enzymes from the parasitic protist Trichomonas vaginalis. Biochimie. 186, 59-72 (2021).

Play Video

記事を引用
Wilson, W. A. Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J. Vis. Exp. (174), e63046, doi:10.3791/63046 (2021).

View Video