Métodos espectrofotométricos para el estudio del metabolismo del glucógeno eucariota

El glucógeno está ampliamente distribuido en la naturaleza, y el compuesto se encuentra en bacterias, muchos protistas, hongos y animales. En los microorganismos, el glucógeno es importante para la supervivencia celular cuando los nutrientes son limitantes y, en organismos superiores como los mamíferos, la síntesis y degradación del glucógeno sirven para amortiguar los niveles de glucosa en sangre ^1,2,3. El estudio del metabolismo del glucógeno es, por lo tanto, de importancia para campos tan diversos como la microbiología y la fisiología de los mamíferos. Comprender el metabolismo del glucógeno requiere estudiar las enzimas clave de la síntesis de glucógeno (glucógeno sintasa y la enzima ramificante) y la degradación del glucógeno (glucógeno fosforilasa y enzima desramificante). Los ensayos estándar de oro de glucógeno sintasa, fosforilasa, ramificación y actividades enzimáticas de desramificación emplean isótopos radiactivos. Por ejemplo, la glucógeno sintasa se mide generalmente en un ensayo radioquímico detenido siguiendo la incorporación de glucosa de UDP-[14 C]glucosa (en el caso de enzimas animales y fúngicas) o ADP-[¹⁴C]glucosa (en el caso de enzimas bacterianas) en glucógeno ^4,5. Del mismo modo, la glucógeno fosforilasa se mide en la dirección de la síntesis de glucógeno, después de la incorporación de glucosa de [¹⁴C] glucosa-1-fosfato en glucógeno⁶. La enzima de ramificación se ensaya midiendo la capacidad de esta enzima para estimular la incorporación de [14 C]glucosa de glucosa-1-fosfato en cadenas ligadas a α1,4 por la glucógeno fosforilasa⁷, y la actividad enzimática de desramificación se determina siguiendo la capacidad de la enzima para incorporar [¹⁴C]glucosa en glucógeno⁸ . Si bien son muy sensibles, lo que permite su uso en extractos de células crudas con bajos niveles de actividad enzimática, los sustratos radiactivos son caros y están sujetos a los requisitos reglamentarios relacionados con el uso de radioisótopos. Estas barreras ponen el uso de ciertos ensayos fuera del alcance de muchos trabajadores. Sin embargo, a lo largo de muchos años, se ha descrito una impresionante variedad de enfoques espectrofotométricos para la medición de estas enzimas. En general, estos enfoques se basan en última instancia en la medición de la producción o el consumo de NADH / NADPH, o la generación de complejos coloreados entre el glucógeno y el yodo. Por lo tanto, son sencillos y se pueden llevar a cabo utilizando espectrofotómetros simples equipados solo con lámparas de flash de tungsteno o xenón.

Los ensayos espectrofotométricos de glucógeno sintasa se basan en la medición del nucleósido difosfato liberado por el donante de nucleótido de azúcar a medida que la glucosa se agrega a la creciente cadena de glucógeno ^9,10. El procedimiento para medir la actividad de la glucógeno sintasa descrito en la sección 1 del protocolo, a continuación, es una modificación de la descrita por Wayllace et ^al.11, y el esquema de acoplamiento se muestra a continuación:

(Glucosa) _n + UPD-glucosa → (glucosa)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + fosfoenolpiruvato → piruvato + ATP

Piruvato + NADH + H+ → Lactato + NAD⁺

La glucógeno sintasa agrega glucosa de UDP-glucosa al glucógeno. El UDP generado en este proceso se convierte en UTP por nucleósido difosfato quinasa (NDP quinasa), en una reacción que genera ADP. El ADP, a su vez, sirve como sustrato para la piruvato quinasa, que fosforila el ADP utilizando fosfoenolpiruvato como donante de fosfato. El piruvato resultante se convierte en lactato por la enzima lactato deshidrogenasa en una reacción que consume NADH. Por lo tanto, el ensayo se puede realizar de manera continua, monitoreando la disminución de la absorbancia a 340 nm a medida que se consume NADH. Se adapta fácilmente para su uso con enzimas que requieren ADP-glucosa como donante de glucosa. Aquí, los pasos de acoplamiento son más simples ya que el ADP liberado por la acción de la glucógeno sintasa es directamente actuado por la piruvato quinasa.

Hay una variedad de ensayos espectrofotométricos disponibles para la determinación de la actividad de la glucógeno fosforilasa. En la versión clásica, la enzima es impulsada hacia atrás, en la dirección de la síntesis de glucógeno, como se muestra a continuación:

(Glucosa) _n + Glucosa-1-fosfato → (Glucosa)_n+1 + P_i

A intervalos de tiempo, se eliminan las alícuotas de la mezcla de reacción y se cuantifica la cantidad de fosfato liberado^12,13. En nuestras manos, este ensayo ha sido de uso limitado debido a la presencia de fosfato libre fácilmente medible en muchas preparaciones comerciales de glucosa-1-fosfato, combinado con las altas concentraciones de glucosa-1-fosfato requeridas para la acción de la fosforilasa. Más bien, hemos empleado rutinariamente un ensayo alternativo que mide la glucosa-1-fosfato liberada a medida que el glucógeno es degradado por la fosforilasa¹³. Se emplea un esquema de reacción acoplada, ilustrado a continuación.

(Glucosa) n + P_i → (Glucosa)_n-1 + _{Glucosa-1-fosfato}

Glucosa-1-fosfato → Glucosa-6-fosfato

Glucosa-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogluconolactona + NADPH + H⁺

La glucosa-1-fosfato se convierte en glucosa-6-fosfato por la fosfoglucomutasa, y la glucosa-6-fosfato se oxida a 6-fosfogluconolactona, con la reducción concomitante de NADP ⁺ a NADPH. El procedimiento detallado en la sección 2 del protocolo, a continuación, se deriva de los métodos descritos por Mendicino et al.14 y Schreiber & Bowling ¹⁵. El ensayo se puede realizar fácilmente de manera continua, con el aumento de la absorbancia a 340 nm con el tiempo, lo que permite la determinación de la velocidad de reacción.

La determinación espectrofotométrica de la actividad enzimática desramificante se basa en la medición de la glucosa liberada por la acción de la enzima sobre la dexforilasa límite de dextrina¹⁶. Este compuesto se elabora tratando el glucógeno exhaustivamente con glucógeno fosforilasa. Dado que la acción de la glucógeno fosforilasa detiene 4 residuos de glucosa lejos de un punto de ramificación α1,6, el límite de dextrina contiene glucógeno, cuyas cadenas externas se han acortado a ~ 4 residuos de glucosa. La preparación de la dextrina límite de fosforilasa se describe aquí, utilizando un procedimiento derivado de los desarrollados por Taylor et al.17 y Makino & Omichi¹⁸.

La desramificación es un proceso de dos pasos. La actividad de la 4-α-glucanotransferasa de la enzima desramificante bifuncional transfiere primero tres residuos de glucosa desde el punto de ramificación al extremo no reductor de una cadena de glucosa cercana ligada a α1,4. El único residuo de glucosa ligado a α1,6 que queda en el punto de ramificación es hidrolizado por la actividad de la α1,6-glucosidasa¹⁹. El ensayo generalmente se realiza de manera detenida, la glucosa liberada después de un tiempo determinado (o serie de veces) se mide en un ensayo enzimático acoplado como se muestra a continuación:

(Glucosa) n → (Glucosa)_n-1 + Glucosa

Glucosa + ATP → Glucosa-6-fosfato + ADP

Glucosa-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogluconolactona + NADPH + H⁺

La determinación de NADPH producido da una medida de la producción de glucosa. El procedimiento descrito en la sección 3 del protocolo, a continuación, se basa en uno descrito por Nelson et ^al.16. Al igual que los otros métodos que dependen del consumo o la generación de NADH / NADPH, el ensayo es bastante sensible. Sin embargo, la presencia de amilasas u otras glucosidasas, que también pueden liberar glucosa libre de la dextrina límite fosforilasa, causará interferencia significativa (ver Discusión).

La determinación colorimétrica de la actividad enzimática ramificada se basa en el hecho de que las cadenas de glucosa α1,4 adheridas adoptan estructuras helicoidales que se unen al yodo, formando complejos coloreados²⁰. El color del complejo formado depende de la longitud de las cadenas enlazadas α1,4. Por lo tanto, la amilosa, que consiste en cadenas largas, en gran parte no ramificadas, de glucosa ligada a α1,4, forma un complejo azul profundo con yodo. En contraste, los glucógenos, cuyas cadenas externas son generalmente del orden de solo 6 a 8 residuos de glucosa de largo, forman complejos de color rojo anaranjado. Si una solución de amilosa se incuba con enzima ramificada, la introducción de ramas en la amilosa da como resultado la generación de cadenas de glucosa ligadas a α1,4 más cortas. Por lo tanto, el máximo de absorción de los complejos amilosa / yodo se desplaza hacia longitudes de onda más cortas. El procedimiento discutido aquí se deriva del detallado por Boyer & Preiss²¹ y la actividad enzimática de ramificación se cuantifica como una reducción en la absorción del complejo amilosa / yodo a 660 nm con el tiempo.

Como debería ser fácilmente evidente a partir de la discusión anterior, el hecho de que los colores de los complejos formados entre las cadenas de yodo y α1,4-glucosa varíen con la longitud de la cadena significa que los espectros de absorbancia de los complejos glucógeno/yodo deberían variar con el grado de ramificación del glucógeno. Este es de hecho el caso, y los glucógenos / glucógenos menos ramificados con cadenas externas más largas absorben la luz a una longitud de onda más larga que los glucógenos que son más ramificados / tienen cadenas externas más cortas. Por lo tanto, la reacción de tinción de yodo puede utilizarse para obtener datos rápidos y cualitativos sobre el grado de ramificación del glucógeno²². El color marrón anaranjado se forma cuando los complejos de glucógeno con yodo no son particularmente intensos. Sin embargo, el desarrollo del color puede mejorarse con la inclusión de una solución saturada de cloruro de calcio²². Esto aumenta la sensibilidad del método unas 10 veces y permite un análisis rápido de cantidades de microgramos de glucógeno. El ensayo para la determinación de la ramificación descrito en la sección 4 del protocolo, a continuación, está adaptado de un procedimiento desarrollado por Krisman²². Se lleva a cabo simplemente combinando la muestra de glucógeno con solución de yodo y cloruro de calcio en una cubeta y recogiendo el espectro de absorción de 330 nm a 800 nm. El máximo de absorbancia cambia hacia longitudes de onda más largas a medida que disminuye el grado de ramificación.

En conjunto, los métodos descritos aquí proporcionan medios simples y confiables para evaluar las actividades de las enzimas clave del metabolismo del glucógeno y para obtener datos cualitativos sobre el alcance de la ramificación del glucógeno.