O uso combinado da tecnologia de matriz de microeletrodos e estimulação química induzida por 4 aminopirdina para investigar a atividade nociceptiva em nível de rede no chifre dorsal da medula espinhal é delineado.
As funções e a conectividade de tipos específicos de neurônios dentro do chifre dorsal da medula espinhal (DH) estão sendo delineados em uma velocidade rápida para fornecer uma visão cada vez mais detalhada dos circuitos que sustentam o processamento da dor na coluna vertebral. No entanto, os efeitos dessas conexões para uma atividade de rede mais ampla no DH permanecem menos bem compreendidos porque a maioria dos estudos se concentra na atividade de neurônios únicos e microcircuitos pequenos. Alternativamente, o uso de matrizes de microeletrodos (MEAs), que podem monitorar a atividade elétrica em muitas células, proporciona alta resolução espacial e temporal da atividade neural. Aqui, descreve-se o uso de MEAs com fatias de medula espinhal de camundongos para estudar a atividade de DH induzida por circuitos dh quimicamente estimulantes com 4-aminopirridina (4-AP). A atividade rítmica resultante é restrita ao DH superficial, estável ao longo do tempo, bloqueada por tetrodotoxina, e pode ser investigada em diferentes orientações de fatias. Em conjunto, esta preparação fornece uma plataforma para investigar a atividade do circuito de DH em tecidos de animais ingênuos, modelos animais de dor crônica e camundongos com função nociceptiva geneticamente alterada. Além disso, gravações de MEA em fatias de medula espinhal estimuladas por 4-AP podem ser usadas como uma ferramenta de triagem rápida para avaliar a capacidade de novos compostos antinociceptivos para interromper a atividade na DH medular.
Os papéis de tipos específicos de interneurônios inibitórios e excitatórios dentro da DH medula espinhal estão sendo descobertos a uma velocidade rápidade 1,2,3,4. Juntos, os interneurônios compõem mais de 95% dos neurônios no DH e estão envolvidos no processamento sensorial, incluindo a nocicepção. Além disso, esses circuitos interneurônios são importantes para determinar se os sinais periféricos ascendem ao neuroaxis para atingir o cérebro e contribuem para a percepção da dor 5,6,7. Até o momento, a maioria dos estudos investigou o papel dos neurônios DH no nível de análise unicelular ou organismo inteiro usando combinações de eletrofisiologia intracelular in vitro, rotulagem neuroanatomética e análise comportamental in vivo 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Essas abordagens avançaram significativamente na compreensão do papel das populações específicas de neurônios no processamento da dor. No entanto, permanece uma lacuna na compreensão de como tipos celulares específicos e pequenos macro-circuitos influenciam grandes populações de neurônios em um nível de microcircuito para posteriormente moldar a saída do DH, respostas comportamentais e a experiência de dor.
Uma tecnologia que pode investigar a função de macro-circuito ou nível multicelular é a matriz de microeletrodos (MEA)15,16. Os MEAs têm sido usados para investigar a função do sistema nervoso por várias décadas17,18. No cérebro, eles facilitaram o estudo do desenvolvimento neuronal, plasticidade sináptica, triagem farmacológica e teste de toxicidade17,18. Eles podem ser usados tanto para aplicações in vitro quanto in vivo, dependendo do tipo de MEA. Além disso, o desenvolvimento de MEAs evoluiu rapidamente, com diferentes números de eletrodos e configurações agora disponíveis19. Uma vantagem fundamental dos MEAs é sua capacidade de avaliar simultaneamente a atividade elétrica em muitos neurônios com alta precisão espacial e temporal através de múltiplos eletrodos15,16. Isso fornece uma leitura mais ampla de como os neurônios interagem em circuitos e redes, sob condições de controle e na presença de compostos aplicados localmente.
Um desafio das preparações in vitro de DH é que os níveis de atividade contínuos são tipicamente baixos. Aqui, este desafio é abordado em circuitos DH da medula espinhal usando o bloqueador de canal K+ com espaço de tensão, 4-aminopryidina (4-AP), para estimular quimicamente circuitos DH. Esta droga tem sido usada anteriormente para estabelecer atividade elétrica síncronica rítmica no DH de fatias agudas da medula espinhal e sob condições in vivo agudas 20,21,22,23,24. Esses experimentos utilizaram patch unicelular e gravação extracelular ou imagem de cálcio para caracterizar atividade induzida por 4-AP 20,21,22,23,24,25. Juntos, este trabalho demonstrou a exigência de transmissão sináptica excitatória e inibitória e sinapses elétricas para atividade rítmica induzida por 4-AP. Assim, a resposta 4-AP tem sido vista como uma abordagem que desmascara circuitos de DH polissinápticos nativos com relevância biológica e não como um epifenomenon induzido por drogas. Além disso, a atividade induzida por 4-AP exibe um perfil de resposta semelhante às drogas analgésicas e antiepilépticas como condições de dor neuropática e tem sido usada para propor novos alvos de drogas analgésicas de base espinhal, como connexins 20,21,22.
Aqui, é descrita uma preparação que combina MEAs e ativação química do DH espinhal com 4-AP para estudar este circuito nociceptivo no macro-circuito, ou nível de rede de análise. Esta abordagem fornece uma plataforma estável e reprodutível para investigar circuitos nociceptivos sob condições ingênuas e neuropáticas “semelhantes à dor”. Esta preparação também é prontamente aplicável para testar a ação em nível de circuito de analgésicos conhecidos e para exibir novos analgésicos na medula espinhal hiperativa.
Apesar da importância da DH espinhal na sinalização nociceptiva, no processamento e nas respostas comportamentais e emocionais resultantes que caracterizam a dor, os circuitos nessa região permanecem mal compreendidos. Um dos principais desafios na investigação desta questão tem sido a diversidade de populações de neurônios que compõem esses circuitos 6,31,32. Os recentes avanços nas tecnologias transgênicas, lidera…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo National Health and Medical Research Council (NHMRC) da Austrália (bolsas 631000, 1043933, 1144638 e 1184974 para B.A.G. e R.J.C.) e o Hunter Medical Research Institute (bolsa para B.A.G. e R.J.C.).
4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
Carbonox (Carbogen – 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
Custom made air interface incubation chamber | |||
Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
MATLAB | MathWorks | R2018b | |
MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8×8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8×8 square grid (200/30) or a 6×10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |