脊髄後角におけるネットワークレベルの侵害受容活性を調査するための微小電極アレイ技術と4-アミノピリジン誘発化学刺激の併用が概説される。
脊髄後角(DH)内の特定のタイプのニューロンの役割と接続性は、脊髄疼痛処理を支える回路のますます詳細なビューを提供するために、急速に描写されています。しかし、DHにおけるより広範なネットワーク活動に対するこれらの接続の効果は、ほとんどの研究が単一のニューロンおよび小さな微小回路の活動に焦点を当てているため、あまりよく理解されていないままである。あるいは、多くの細胞にわたる電気的活動を監視できる微小電極アレイ(MEA)の使用は、神経活動の高い空間的および時間的分解能を提供する。ここでは、4-アミノピリジン(4-AP)でDH回路を化学的に刺激することによって誘導されるDH活性を研究するために、マウス脊髄スライスを有するMEAの使用が記載されている。結果として生じるリズミカル活性は、表在DHに制限され、経時的に安定し、テトロドトキシンによって遮断され、異なるスライス配向で調査することができる。一緒に、この調製物は、ナイーブ動物、慢性疼痛の動物モデル、および遺伝的に変更された侵害受容機能を有するマウスからの組織におけるDH回路活性を調査するためのプラットフォームを提供する。さらに、4-AP刺激脊髄スライスにおけるMEA記録は、脊髄DHにおける活性を破壊する新規抗侵害受容性化合物の能力を評価するための迅速なスクリーニングツールとして使用することができる。
脊髄DH内の特定のタイプの抑制性および興奮性介在ニューロンの役割は、急速な速度で明らかにされている1,2,3,4。一緒に、介在ニューロンはDHのニューロンの95%以上を占め、侵害受容を含む感覚処理に関与しています。さらに、これらのニューロン間回路は、末梢信号が神経軸を上昇して脳に到達し、痛みの知覚に寄与するかどうかを決定するために重要である5、6、7。今日まで、ほとんどの研究は、in vitro細胞内電気生理学、神経解剖学的標識、およびin vivo行動分析の組み合わせを用いて、単一細胞または生物全体の分析のいずれかでDHニューロンの役割を調査してきた1,3,8,9,10,11,12,13,14 .これらのアプローチは、疼痛処理における特定のニューロン集団の役割の理解を著しく進歩させた。しかし、特定の細胞型と小さなマクロ回路が、マイクロ回路レベルでニューロンの大規模な集団にどのように影響し、その後DHの出力、行動応答、および疼痛経験を形成するかを理解するには、ギャップが残っています。
マクロ回路または多細胞レベルの機能を調査できる技術の1つは、微小電極アレイ(MEA)15,16である。MEAは、数十年にわたって神経系の機能を調査するために使用されてきました17,18。脳内では、ニューロン発生、シナプス可塑性、薬理学的スクリーニング、毒性試験の研究が容易になりました17,18。これらは、MEAの種類に応じて、インビトロおよびインビボの両方の用途に使用できます。さらに、MEAの開発は急速に進化しており、さまざまな電極番号と構成が利用可能になりました19。MEAの主な利点は、複数の電極を介して高い空間的および時間的精度で多くのニューロンにおける電気的活動を同時に評価する能力である15,16。これは、ニューロンが回路およびネットワーク内で、制御条件下で、局所的に適用された化合物の存在下でどのように相互作用するかのより広範な読み出しを提供する。
in vitroDH製剤の1つの課題は、進行中の活性レベルが典型的には低いことである。ここでは、この課題は、DH回路を化学的に刺激するために電位依存性K+チャネル遮断薬である4-アミノプリイジン(4-AP)を使用する脊髄DH回路で対処されています。この薬剤は、以前は急性脊髄スライスのDHにおいて、および急性in vivo条件下でのリズミカルな同期電気的活性を確立するために使用されてきた20、21、22、23、24。これらの実験は、4−AP誘導活性20、21、22、23、24、25を特徴付けるために、単一細胞パッチおよび細胞外記録またはカルシウムイメージングを用いてきた。一緒に、この研究は、リズミカルな4-AP誘導活性のための興奮性および抑制性のシナプス伝達および電気シナプスの要件を実証した。したがって、4-AP応答は、薬物誘発性エピ現象としてではなく、生物学的関連性を有する天然の多シナプスDH回路を覆い隠すアプローチとして見なされてきた。さらに、4-AP誘導活性は、神経因性疼痛状態として鎮痛薬および抗てんかん薬に対して同様の応答プロファイルを示し、コネキシンなどの新規な脊髄ベースの鎮痛薬標的を提案するために使用されている20、21、22。
ここでは、MEAsと脊髄DHの化学的活性化を4-APと組み合わせて、この侵害受容回路をマクロ回路またはネットワークレベルの分析で研究する調製物が記載されている。このアプローチは、素朴で神経因性の「痛みのような」条件下で侵害受容回路を調査するための安定した再現可能なプラットフォームを提供する。この調製物はまた、既知の鎮痛薬の回路レベルの作用を試験し、亢進性脊髄における新規鎮痛薬をスクリーニングするためにも容易に適用可能である。
侵害受容性シグナル伝達、処理、および痛みを特徴付ける結果として生じる行動的および感情的応答における脊髄DHの重要性にもかかわらず、この領域内の回路はほとんど理解されていないままである。この問題を調査する上での重要な課題は、これらの回路6,31,32を構成するニューロン集団の多様性であった。光遺伝学と…
The authors have nothing to disclose.
この研究は、オーストラリアの国立保健医療研究評議会(NHMRC)(B.A.G.およびR.J.C.への助成金631000、1043933、1144638、および1184974)とハンター医学研究所(B.A.G.およびR.J.C.への助成金)から資金提供を受けました。
4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
Carbonox (Carbogen – 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
Custom made air interface incubation chamber | |||
Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
MATLAB | MathWorks | R2018b | |
MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8×8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8×8 square grid (200/30) or a 6×10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |