여기서, 우리는 단백질 소화, 펩타이드 정제 및 데이터 독립적 인 수집 분석과 같은 상세한 정보와 함께 최적화 된 필터 소화 프로토콜을 제시합니다. 이 전략은 발현 된 전립선 분비 소변 샘플의 분석에 적용되며 높은 프로테아메 커버리지와 오줌 프로테오메의 낮은 누락 된 값 라벨 프리 프로파일링을 허용합니다.
필터 보조 시료 프로토콜(FASP)은 희석된 시료를 농축할 수 있고 다양한 세제와 호환되기 때문에 프로테오믹스 시료 제조에 널리 사용된다. FASP와 같은 상향식 프로테오믹스 워크플로우는 데이터 독립적 분석(DIA) 모드에서 수행되는 LC-MS/MS 방법에 점점 더 의존하고 있으며, 이는 깊은 프로테오메 커버리지와 누락된 값의 낮은 발생률을 허용하는 스캐닝 방법입니다.
이 보고서에서는 오줌 프로테오메 매핑을 위해 DIA 모드에서 FASP 프로토콜, 이중 StageTip 정화 단계 및 LC-MS/MS를 결합한 워크플로우의 세부 정보를 제공합니다. 모델 샘플로서, 우리는 전립선암 바이오마커 발견 연구에 관심이 있는 디지털 직장 검사(DRE)를 거쳐 수집된 샘플인 발현 전립선 분비물(EPS)-소변을 분석하였다.
프로테오믹 기술의 지속적인 진화는 조직 및 생물유체와 같은 다양한 샘플에 존재하는 주요 분자 효과자의 고해상도 지도를 제공함으로써 질병 진단 및 치료에 대한 반응의 예측을 돕는 데 상당한 영향을 미칠 것을 약속합니다. 분석적 관점에서, 소변은 다른 생물유체1에대하여 프로테오메의 수집용성 및 주요 안정성과 같은 몇 가지 장점을 제공한다. 소변의 프로테오믹 분석은 관심 있는 조직에 근접하여 비침습적 샘플링을 허용하기 때문에 비뇨기과암에 대한 바이오마커 발견 연구에 특별한 관심을 갖는다2. 특히, 전립선 관련 병리를 연구하기 위해 유망한 것으로 보이는 샘플은 EPS-소변3,4(즉, 디지털 직장 검사(DRE)후에 수집된 소변 샘플입니다). 샘플 수집 전에 이 후자의 수술은 전립선 특정 단백질로 소변을 풍부하게 합니다. EPS-소변은 전립선암(PCa)을 포함한전립선5와 관련된 장애를 조사하기에 좋은 후보이며, DRE를 통해 종양에 의해 분비된 단백질을 소변 샘플에 부어 암 조직 별 단백질을 검출할 가능성이 높아지도록 한다.
잠재적인 단백질 바이오마커의 검출 및 정량화를 허용하는 데 있어 중요한 역할은 질량 분석법(MS)에 의해 재생됩니다. 지난 2년 동안, 프로테오믹 분석을 위한 MS 기반 프로토콜은 MS 계측 및 데이터 분석 소프트웨어6의지속적인 개선 덕분에 단일 LC-MS/MS 실행에서 점점 더 많은 단백질을 검출할 수 있게 해 주었다.
MS 기반 프로테오믹 시료 제제는 일반적으로 단백질 혼합물의 효소 소화를 수반하며, 이는 용액 소화, MStern 블로팅7,서스펜션 트래핑(S-trap)8,고체 상 강화 샘플 제제(SP3)9,단계내 정제소화(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FAS1) 및 필터 처리 시료 준비(FASP1) 및 필터 처리 시료 준비(FA 모든 프로토콜은 오줌 프로테오믹스에 사용될 수 있으며, 비록 결과가 확인된 단백질 및 펩티드의 수와재현성(12)의수에 따라 달라질 수 있더라도.
이 작품에서, 우리의 관심은 FASP 프로토콜에 의해 EPS 소변의 분석에 집중되었다. FASP 프로토콜은 원래 조직 및 세포 배양에서 추출한 단백질을 분석하도록 설계되었지만, 그 사용은소변(13)과같은 다른 샘플 유형의 분석으로 확대되었다. 간단한 용액 소화에 대하여 FASP는 보다 유연한 프로테오믹접근법(14)이며,효소 소화 전 단백질 혼합물로부터 세제 및 염과 같은 기타 오염물질을효과적으로 제거함으로써 최적의 단백질 용윤성 조건을 선택할 수 있게 한다. 더욱이, FASP의 추가 특징은 시료 농도에 대한 수단을 제공한다는 것이다. 이것은 상대적으로 큰 샘플 볼륨 (마이크로 리터의 수백)에서 시작하는 것을 허용하기 때문에, 오줌 proteomic 분석에 대한 특히 관심이다. FASP 프로토콜의 잠재력에 비추어 볼 때, 여러 연구는 실험적 가변성을 줄이고16개의샘플 수를 병렬로 처리하는 것을 목표로 워크플로 자동화에 주의를 기울였습니다.
워크플로우에서 FASP는 높은 프로테오메 커버리지, 양적 정밀도 및 누락된 값의 낮은 발생률을 제공하는 데이터 독립적 분석(DIA)에서 LC-MS/MS 를 획득합니다. DIA 접근 방식은 MS/MS 이벤트에 대해 모든 이온을 선택하는 민감한 방법입니다. DIA 모드에서 작동하는 질량 분광계는 전체 m/z 전구체 범위를 덮는 서로 다른 격리 폭으로 스캔 주기를 수행합니다. 이러한 접근법은 단위 시간당 많은 펩타이드를 재보적으로 검출하여샘플(17)의프로테오믹스 스냅샷을 제공할 수 있다. 또한 DIA에 의해 생성된 데이터는 또 다른 흥미로운 특징을 가지고 있습니다: 후방분석(18)의가능성. DIA 데이터는 DIA의 MS/MS 스펙트럼이 각 m/z 창(19)내에서 여러 전구체 이온의 공동 격리로 인해 발생하기 때문에 DDA에서 얻은 것보다 더 복잡하다. 복합 MS/MS 스펙트럼을 구별하고 특정 펩타이드 신호로 나누면 스펙트럼 라이브러리와 데이터 분석을 위한 전용 소프트웨어라는 두 가지 기본 요소를 사용하여 달성됩니다. 스펙트럼 라이브러리는 일반적으로 프로테오메 커버리지를 최대화하기 위해 펩티드 분획을 포함하는 데이터 의존실험에 의해 생성되며, 이는 고려 중인 샘플에서 검출 가능한 펩타이드의 수천 개의 실험적으로 결정된 전구체 이온 및 MS/MS 스펙트럼 목록을 제공한다. 대신 데이터 분석 소프트웨어는 스펙트럼 라이브러리에 포함된 정보를 사용하여 펩타이드 검출 및 정량화를 허용하는 특정 추출된 이온 크로마토그램을 생성하여 DIA 데이터를 해석합니다. 라이브러리가 없는 DIA 데이터 분석이 가능하지만 라이브러리 기반 DIA는 프로테오메 커버리지20측면에서 더 나은 결과를 제공합니다.
여기서 설명된 샘플 준비프로토콜(도 1)은원심분리 단계(세포 이물질을 제거하기 위해), FASP 소화, StageTip 정제21,단백질 및 DIA 분석의 정량화 와 같은 단계로 구성된다. 이 프로토콜은 전립선암 바이오마커 발견의 맥락에서 EPS-소변의 분석을 위해 설계되었지만, 임의의 소변 샘플의 프로테오믹 분석에 적용될 수 있다.
이 작품에서는 EPS-소변 샘플을 분석하기 위한 전략이 제시됩니다. FASP 프로토콜은 효소 소화 전에 시료 농도를 허용하기 때문에 오줌 프로테오믹스에 이상적인 선택입니다. 사실,이 워크 플로우를 사용하여, 소변의 마이크로 리터의 수백 은 단일 필터에로드 및 처리 될 수 있습니다. 또한, 온 필터 소화는 데스터레이션 조건의 선택에 상대적 자유를 제공합니다. 우리의 작업에서, 단백질 성소는 Tris, SDS 및 DTT를 포함하는 완충제에서 소변 샘플을 희석시킴으로써 달성됩니다 (최종 농도 : 50 mM Tris, 1 % SDS, 50 mM DTT). 단백질은 활성 프로테아제에 의한 원치 않는 분해를 피하기 위해 시료를 해동한 직후 효율적으로 변성됩니다. 원래 FASP 프로토콜은 100 μL에서 200 μL로 세하의 부피를 증가시킴으로써 개선되었습니다. 이러한 방식으로, 필터에서 잔류물, 특히 세제의 더 나은 제거가 달성된다.
효소 소화 후, 빠른 LC-MS/MS를 이용한 외부 표준에 의한 단백질 추정 후, 모든 샘플(2 μg)에 대해 동일한 시동 재질로 DIA 모드에서 이중 StageTip 정제 및 LC-MS/MS 분석을 포함하는 프로토콜의 마지막 단계 전에 데이터 의존적 방법이 수행됩니다.
FASP의 다재다능함은 DIA 접근 방식과 연관되어 있으며, 누락된값(17)의수가 적어지는 민감한 방법입니다. 우리의 일에서, 2387 단백질이 확인되고 정량화되었다, 따라서 EPS 소변의 상세한 proteomic 프로파일을 그릴 수 있게. 2387 단백질의 식별 및 정량화는 풍부한 스펙트럼 라이브러리의 생성을 통해 가능했으며, 펩티드의 고pH 반전 분획을 통해 수득되었으며, 우리의 DIA 방법에 의해 넓은 m/z 전구체 범위를 지향하였다. 이 워크플로우는 이전에 직접 EPS 분석에서 발견된 단백질의 80% 이상을 확인하여 EPS-오줌 프로테오메의 상당 부분이 실제로 발현된 전립선 분비물에서 파생되고, 따라서 전립선 조직 특이적단백질(26)의풍부한 공급원임을 입증한다.
결론적으로, 우리의 실험 디자인은 오줌 proteome의 풍부한지도를 얻기 위해 DIA의 감도와 FASP의 다재 다능함을 결합합니다. 이 전략은 EPS 소변 견본을 분석하기 위하여 추천됩니다, 그러나 그것의 사용은 일반적으로 오줌 proteomics, 또는 그밖 견본 모형으로 확장될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 MIUR (장관 Università Ricerca, PRIN 2017 에서 MG)와 POR 칼라브리아 FESR 2014-2020, 액션 1.2.2, “INNOPROST”에 의해 지원되었다.
1 M Tris HCL pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
2-iodoacetamide for synthesis | Merck | 8047440100 | |
Acetonitrile for HPLC LC-MS grade | VWR | 83640.290 | |
Ammonium acetate | Fluka | 9690 | |
ammonium hydroxide solution | Sigma | 30501 | |
ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water | Merck | 318612-500ML | |
Dithiothreitol | Amresco | 0281-25G | |
Empore Cation 47mm Extraction Disks | Microcolumn | 2251 | |
Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
Formic acid optima | Fisher Scientific | A117-50 | |
Hela Protein Digest Standard | Fisher Scientific | 88329 | |
Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | MERCK | MRCPRT010 | |
sodium dodecyl sulfate solution | Merck | 71736-500ML | |
Thiethylammonium bicarbonate buffer | Merck | T7408-100ML | |
trifluoroacetic acid | Riedel-de Haën | 34957 | |
Trypsin from porcine pancreas | Merck | T6567-1MG | |
Urea | Merck | U6504-500G | |
Water HPLC gradient grade | Fisher Scientific | W/0106/17 | |
Proteome Discoverer 1,4 | Thermo Fisher Scientific | ||
Spectronaut 14.0 | Biognosys |