Qui, presentiamo un protocollo di digestione on-filter ottimizzato con informazioni dettagliate su quanto segue: digestione proteica, purificazione peptidica e analisi di acquisizione indipendente dai dati. Questa strategia viene applicata all’analisi di secrezioni prostatica espresse-campioni di urina e consente un’elevata copertura del proteoma e una profilazione senza etichette a basso valore mancante del proteoma urinario.
Il protocollo fasp (Filter-aided sample protocol) è ampiamente utilizzato per la preparazione del campione di proteomica perché consente di concentrare campioni diluiti ed è compatibile con un’ampia varietà di detergenti. I flussi di lavoro proteomici dal basso verso l’alto come FASP si basano sempre più su metodi LC-MS/MS eseguiti in modalità DIA (Data-Independent Analysis), un metodo di scansione che consente una copertura profonda dei proteomi e una bassa incidenza dei valori mancanti.
In questo report verranno forniti i dettagli di un flusso di lavoro che combina un protocollo FASP, un doppio passaggio di purificazione StageTip e LC-MS/MS in modalità DIA per la mappatura dei proteomi urinari. Come campione di modello, abbiamo analizzato le secrezioni prostatiche espresse (EPS)-urina, un campione raccolto dopo un esame rettale digitale (DRE), che è di interesse negli studi di scoperta del biomarcatore del cancro alla prostata.
La costante evoluzione delle tecnologie proteomiche promette di avere un impatto considerevole nell’aiutare la diagnosi delle malattie e la previsione della risposta al trattamento fornendo mappe ad alta risoluzione dei principali effettori molecolari presenti in un’ampia varietà di campioni come tessuti e biofluidi. Da un punto di vista analitico, l’urina offre diversi vantaggi come la facilità di raccolta e la maggiore stabilità del proteoma rispetto ad altri biofluidi1. L’analisi proteomica delle urine è di particolare interesse negli studi di scoperta di biomarcatori sui tumori urologici, poiché consente il campionamento non invasivo in prossimità dei tessuti di interesse2. In particolare, un campione che sembra promettente per lo studio delle patologie correlate alla prostata è l’EPS-urina3,4 (cioè un campione di urina raccolto dopo un esame rettale digitale (DRE)). Quest’ultima operazione prima della raccolta del campione arricchisce l’urina con proteine specifiche della prostata. L’EPS-urina è un buon candidato per indagare i disturbi legati alla ghiandola prostatica 5 incluso il cancro alla prostata (PCa), poichéattraverso il DRE, le proteine secrete dal tumore possono essere versate nel campione di urina, aumentando la possibilità di rilevare proteine specifiche del tessuto tumorale.
Un ruolo cruciale nel consentire l’individuazione e la quantificazione di potenziali biomarcatori proteici è svolto dalla spettrometria di massa (SM). Negli ultimi due decenni, i protocolli basati su SM per l’analisi proteomica hanno permesso di rilevare un numero sempre crescente di proteine in un’unica esecuzione LC-MS/MS grazie ai continui miglioramenti nella strumentazione MS e nel software di analisi deidati 6.
La preparazione del campione proteomica a base di SM comporta generalmente la digestione enzimatica della miscela proteica, che può essere ottenuta tramite un’ampia varietà di protocolli come: digestione in soluzione, soffiatura MStern7,intrappolamento delle sospensioni (S-trap)8,preparazione del campione potenziata in fase solida (SP3)9,digestione in fase10 e preparazione del campione attrezzata con filtro (FASP)11. Tutti i protocolli possono essere utilizzati per la proteomica urinaria, anche se i risultati possono variare rispetto al numero di proteine e peptidi identificati e in termini di riproducibilità12.
In questo lavoro, la nostra attenzione si è concentrata sull’analisi delle urine EPS mediante il protocollo FASP. Il protocollo FASP è stato originariamente progettato per analizzare le proteine estratte da tessuti e colture cellulari, ma il suo uso è stato poi ampliato all’analisi di altri tipi di campioni, come l’urina13. Per quanto riguarda la semplice digestione in soluzione FASP è un approccio proteomico piùflessibile 14, poiché ottenendo una rimozione efficace di detergenti e altri contaminanti come i sali dalla miscela proteica prima della digestione enzimatica15,consente la scelta di condizioni ottimali di solubilizzazione proteica. Inoltre, un’ulteriore caratteristica del FASP è che fornisce un mezzo per la concentrazione del campione. Questo è di particolare interesse per l’analisi proteomica urinaria, perché consente di partire da volumi di campioni relativamente grandi (centinaia di microlitri). Alla luce delle potenzialità del protocollo FASP, diversi studi hanno focalizzato l’attenzione sull’automazione del flusso di lavoro, con l’obiettivo di ridurre la variabilità sperimentale ed elaborare un numero elevato di campioni in parallelo16.
Nel nostro flusso di lavoro, FASP è seguito dall’acquisizione LC-MS/MS nell’analisi indipendente dai dati (DIA), che fornisce un’elevata copertura proteoma, una buona precisione quantitativa e una bassa incidenza dei valori mancanti. L’approccio DIA è un metodo sensibile in cui tutti gli ioni sono selezionati per gli eventi MS/MS, opposto a ciò che accade nell’analisi dipendente dai dati (DDA) in cui solo gli ioni con la massima intensità sono frammentati. Lo spettrometro di massa, che opera in modalità DIA, esegue cicli di scansione con diversa larghezza di isolamento che copre l’intera gamma di precursori m/z. Questo approccio consente di rilevare in modo riproducibile un elevato numero di peptidi per unità di tempo, fornendo un’istantanea proteomica del campione17. Inoltre, i dati generati da DIA hanno un’altra caratteristica interessante: la possibilità di un’analisi a posteriori 18. I dati DIA sono più complessi di quelli ottenuti dalla DDA, perché gli spettri MS/MS in DIA derivano dal co-isolamento di diversi ioni precursori all’interno di ciascuna finestra m/z 19. Disintare gli spettri MS/MS compositi in segnali peptidici distinti e specifici si ottiene utilizzando due elementi fondamentali: una libreria spettrale e un software dedicato per l’analisi dei dati. La libreria spettrale è generata da un esperimento dipendente dai dati, che di solito coinvolge il frazionamento peptidico per massimizzare la copertura del proteoma, che fornisce un elenco di migliaia di ioni precursori determinati sperimentalmente e spettri MS/MS di peptidi rilevabili nel campione in esame. Il software di analisi dei dati, invece, utilizza le informazioni contenute nella libreria spettrale per interpretare i dati DIA generando specifici cromatogrammi di ioni estratti che consentono il rilevamento e la quantificazione dei peptidi. Mentre l’analisi dei dati DIA senza libreria è ora fattibile, dia basato su libreria fornisce ancora risultati migliori in termini di copertura del proteoma20.
Il protocollo di preparazione del campione qui descritto(Figura 1) consiste nei seguenti passaggi: una fase di centrifugazione (per rimuovere i detriti cellulari), digestione FASP, purificazione stagetip21,quantificazione delle proteine e analisi DIA. Questo protocollo è stato progettato per l’analisi dell’EPS-urina nel contesto della scoperta del biomarcatore del cancro alla prostata, ma può essere applicato all’analisi proteomica di qualsiasi campione di urina.
In questo lavoro viene presentata una strategia per l’analisi dei campioni di urina EPS. Il protocollo FASP è la scelta ideale per la proteomica urinaria perché consente la concentrazione del campione prima della digestione enzimatica. Infatti, utilizzando questo flusso di lavoro, diverse centinaia di microlitri di urina possono essere caricati su un singolo filtro ed elaborati. Inoltre, la digestione a filtro offre una relativa libertà nella scelta delle condizioni di denaturazione. Nel nostro lavoro, la denaturazione proteica si ottiene diluire campioni di urina in un tampone contenente Tris, SDS e DTT (concentrazione finale: 50 mM Tris, 1% SDS, 50 mM DTT). Le proteine vengono denaturate in modo efficiente immediatamente dopo lo scongelamento del campione, al fine di evitare la degradazione indesiderata da parte delle proteasi attive. Il protocollo FASP originale è stato migliorato aumentando il volume dei lavaggi da 100 μL a 200 μL. In questo modo, si ottiene una migliore rimozione dei residui, in particolare dei detergenti dal filtro.
Dopo la digestione enzimatica, la stima delle proteine per standard esterno utilizzando un rapido LC-MS/MS, il metodo dipendente dai dati viene eseguito prima degli ultimi passaggi del protocollo, che comprendono la purificazione double StageTip e l’analisi LC-MS/MS in modalità DIA, su materiale di partenza uguale per tutti i campioni (2 μg).
La versatilità di FASP è associata all’approccio DIA, un metodo sensibile che fornisce un basso numero di valori mancanti17. Nel nostro lavoro, sono state identificate e quantificate 2387 proteine, consentendo così di disegnare un profilo proteomico dettagliato dell’EPS-urina. L’identificazione e la quantificazione di 2387 proteine è stata possibile attraverso la generazione di una ricca libreria spettrale, ottenuta attraverso il frazionamento invertito ad alto pH dei peptidi, e con il nostro metodo DIA, diretto ad un ampio intervallo precursore m/z. Questo flusso di lavoro ha identificato oltre l’80% delle proteine precedentemente trovate nell’analisi direct-EPS, dimostrando che una notevole frazione del proteoma urinario EPS è effettivamente derivata da secrezioni prostatiche espresse, quindi è una ricca fonte di proteine specifiche del tessuto prostatico26.
In conclusione, il nostro design sperimentale accoppia la versatilità di FASP con la sensibilità di DIA al fine di ottenere una ricca mappa del proteoma urinario. Questa strategia è raccomandata per l’analisi di campioni di urina EPS, ma il suo uso può essere esteso alla proteomica urinaria in generale o anche ad altri tipi di campioni.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal MIUR (Ministero Università Ricerca, PRIN 2017 a MG) e da POR Calabria FESR 2014-2020, azione 1.2.2, “INNOPROST”.
1 M Tris HCL pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
2-iodoacetamide for synthesis | Merck | 8047440100 | |
Acetonitrile for HPLC LC-MS grade | VWR | 83640.290 | |
Ammonium acetate | Fluka | 9690 | |
ammonium hydroxide solution | Sigma | 30501 | |
ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water | Merck | 318612-500ML | |
Dithiothreitol | Amresco | 0281-25G | |
Empore Cation 47mm Extraction Disks | Microcolumn | 2251 | |
Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
Formic acid optima | Fisher Scientific | A117-50 | |
Hela Protein Digest Standard | Fisher Scientific | 88329 | |
Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | MERCK | MRCPRT010 | |
sodium dodecyl sulfate solution | Merck | 71736-500ML | |
Thiethylammonium bicarbonate buffer | Merck | T7408-100ML | |
trifluoroacetic acid | Riedel-de Haën | 34957 | |
Trypsin from porcine pancreas | Merck | T6567-1MG | |
Urea | Merck | U6504-500G | |
Water HPLC gradient grade | Fisher Scientific | W/0106/17 | |
Proteome Discoverer 1,4 | Thermo Fisher Scientific | ||
Spectronaut 14.0 | Biognosys |