هنا، نقدم بروتوكول هضم محسن على فلتر مع معلومات مفصلة حول ما يلي: هضم البروتين، وتنقية الببتيد وتحليل اقتناء البيانات المستقلة. يتم تطبيق هذه الاستراتيجية على تحليل عينات إفرازات البول البروستاتا المعبر عنها وتسمح بتغطية عالية للبروتيوم وتنميط خالي من التسمية منخفض القيمة المفقودة للبروتيوم البولي.
يستخدم بروتوكول العينة بمساعدة المرشح (FASP) على نطاق واسع لإعداد عينات البروتيوميات لأنه يسمح بتركيز العينات المخففة وهو متوافق مع مجموعة واسعة من المنظفات. تعتمد سير عمل البروتيوميات من أسفل إلى أعلى مثل FASP بشكل متزايد على أساليب LC-MS/MS التي يتم إجراؤها في وضع التحليل المستقل للبيانات (DIA) ، وهي طريقة مسح تسمح بتغطية البروتيوم العميقة وانخفاض معدل حدوث القيم المفقودة.
في هذا التقرير، سنقدم تفاصيل سير العمل الذي يجمع بين بروتوكول FASP، وخطوة تنقية مزدوجة StageTip وLC-MS/MS في وضع DIA لرسم خرائط البروتيوم البولي. كعينة نموذجية، قمنا بتحليل الإفرازات البروستاتا المعبر عنها (EPS) – البول، وهي عينة تم جمعها بعد فحص المستقيم الرقمي (DRE)، والتي هي ذات أهمية في دراسات اكتشاف العلامات الحيوية لسرطان البروستاتا.
التطور المستمر للتكنولوجيات بروتيوميك وعود أن يكون لها تأثير كبير في المساعدة على تشخيص المرض والتنبؤ بالاستجابة للعلاج من خلال توفير خرائط عالية الدقة من التأثيرات الجزيئية الرئيسية الموجودة في مجموعة واسعة من العينات مثل الأنسجة والفلوريدات الحيوية. من وجهة نظر تحليلية ، يقدم البول العديد من المزايا مثل سهولة جمع البروتيوم والاستقرار الكبير فيما يتعلق بالآخرين بيوفلويدس1. تحليل بروتيوميك البول هو من مصلحة خاصة في دراسات اكتشاف العلامات الحيوية على سرطان المسالك البولية، لأنه يسمح أخذ العينات غير الباضعة على مقربة من الأنسجة ذات الأهمية2. على وجه الخصوص ، عينة يبدو أنها واعدة لدراسة الأمراض المرتبطة بالبروستاتا هي EPS-urine3،4 (أي عينة البول التي تم جمعها بعد فحص المستقيم الرقمي (DRE)). هذه العملية الأخيرة قبل جمع العينات يثري البول مع بروتينات البروستاتا محددة. EPS-البول هو مرشح جيد للتحقيق في الاضطرابات المتعلقة غدة البروستاتا5 بما في ذلك سرطان البروستاتا (PCa)، منذ من خلال DRE، يمكن سكب البروتينات التي يفرزها الورم في عينة البول، مما يزيد من فرصة الكشف عن البروتينات سرطان الأنسجة الخاصة.
يلعب قياس الطيف الكتلي دورا حاسما في السماح بالكشف عن المؤشرات الحيوية المحتملة للبروتين وتحديد كميتها. على مدى العقدين الماضيين، سمحت البروتوكولات القائمة على التصلب المتعدد للتحليل البروتيني بالكشف عن عدد متزايد من البروتينات في تشغيل LC-MS/MS واحد بفضل التحسينات المستمرة في أجهزة التصلب المتعدد وفي برنامج تحليل البيانات6.
MS القائم على إعداد عينة بروتيوميك عموما ينطوي على الهضم الأنزيمي من خليط البروتين، والتي يمكن تحقيقها من خلال مجموعة واسعة من البروتوكولات مثل: الهضم في الحل، MStern النشاف7،تعليق محاصرة (S-فخ)8،الصلبة مرحلة تعزيز إعداد العينة (SP3)9،في المرحلة الهضم10 ومرشح إعداد العينة بمساعدة (FASP)11. يمكن استخدام جميع البروتوكولات لعلم البروتيومات البولية، على الرغم من أن النتائج قد تختلف فيما يتعلق بعدد البروتينات والببتيدات المحددة ومن حيث القابلية للاستنساخ12.
وفي هذا العمل، تركز اهتمامنا على تحليل بول EPS بواسطة بروتوكول FASP. تم تصميم بروتوكول FASP في الأصل لتحليل البروتينات المستخرجة من الأنسجة وثقافات الخلايا ، ولكن تم توسيع استخدامه بعد ذلك إلى تحليل أنواع العينات الأخرى ، مثل البول13. فيما يتعلق مباشرة في حل الهضم FASP هو نهج أكثر مرونة بروتيوميك14، لأنه من خلال تحقيق إزالة فعالة من المنظفات وغيرها من الملوثات مثل الأملاح من خليط البروتين قبل الهضم الأنزيمي15، فإنه يسمح باختيار ظروف التشحيم البروتين الأمثل. وعلاوة على ذلك، هناك خاصية إضافية ل FASP وهي أنها توفر وسيلة لتركيز العينة. هذا هو ذات أهمية خاصة لتحليل بروتيوميك البولية، لأنه يسمح للبدء من أحجام عينة كبيرة نسبيا (مئات من microliters). وفي ضوء إمكانات بروتوكول نظام الدراسة المتعلقة بالمعاملات المناخية، ركزت عدة دراسات الاهتمام على أتمتة سير العمل، بهدف الحد من التباين التجريبي ومعالجة عدد مرتفع من العينات بالتوازي مع16عينة.
في سير العمل لدينا، ويتبع FASP من قبل LC-MS / MS اكتساب في تحليل البيانات المستقلة (DIA)، الذي يوفر تغطية البروتيوم عالية، والدقة الكمية الجيدة وانخفاض معدل الإصابة بالقيم المفقودة. أسلوب DIA هو أسلوب حساس حيث يتم تحديد كافة الأيونات لأحداث MS/MS، عكس ما يحدث في تحليل البيانات المعتمدة (DDA) حيث يتم تجزئة الأيونات ذات الكثافة الأعلى فقط. يقوم مطياف الكتلة، الذي يعمل في وضع DIA، بإجراء دورات المسح الضوئي بعرض عزل مختلف يغطي مجموعة السلائف m/z بأكملها. هذا النهج يسمح للكشف عن عدد كبير من الببتيدات في وقت الوحدة ، وتوفير لقطة بروتيوميكس من العينة17. وعلاوة على ذلك، البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة DIA لها سمة أخرى مثيرة للاهتمام: إمكانية التحليل الخلفي18. بيانات DIA أكثر تعقيدا من تلك التي تم الحصول عليها من قبل DDA، لأن أطياف MS/MS في DIA ناتجة عن العزل المشترك للعديد من أيونات السلائف داخل كل نافذة m/z 19. يتم فصل أطياف MS/MS المركبة إلى إشارات ببتيد متميزة ومحددة باستخدام عنصرين أساسيين: مكتبة طيفية وبرنامج مخصص لتحليل البيانات. يتم إنشاء المكتبة الطيفية من خلال تجربة تعتمد على البيانات ، وعادة ما تنطوي على تجزئة الببتيد لتحقيق أقصى قدر من تغطية البروتيوم ، والتي توفر قائمة بالآلاف من أيونات السلائف المحددة تجريبيا وأطياف MS / MS من الببتيدات التي يمكن اكتشافها في العينة قيد النظر. وبدلا من ذلك، يستخدم برنامج تحليل البيانات المعلومات الواردة في المكتبة الطيفية لتفسير بيانات DIA من خلال توليد كروماتوجرامات أيونية مستخرجة محددة تسمح باكتشاف الببتيد وتحديد كميتها. في حين أن تحليل بيانات DIA الخالي من المكتبة أصبح ممكنا الآن ، إلا أن DIA المستندة إلى المكتبة لا تزال توفر نتائج أفضل من حيث تغطية البروتيوم20.
بروتوكول إعداد العينة هنا وصف(الشكل 1)يتكون من الخطوات التالية: خطوة الطرد المركزي (لإزالة حطام الخلية)، FASP الهضم، StageTip تنقية21،كمية من البروتينات وتحليل DIA. وقد تم تصميم هذا البروتوكول لتحليل EPS البول في سياق اكتشاف العلامات الحيوية لسرطان البروستاتا، ولكن يمكن تطبيقه على التحليل البروتيني لأي عينة البول.
في هذا العمل، يتم تقديم استراتيجية لتحليل عينات البول EPS. بروتوكول FASP هو الخيار المثالي لعلم البروتيوميات البولية لأنه يسمح بتركيز العينة قبل الهضم الأنزيمي. في الواقع، باستخدام سير العمل هذا، يمكن تحميل عدة مئات من ميكرولترات البول على مرشح واحد ومعالجتها. وعلاوة على ذلك، يوفر الهضم على مرشح الحرية النسبية في اختيار ظروف التشبع. في عملنا، يتم تحقيق تشبع البروتين عن طريق تمييع عينات البول في العازلة التي تحتوي على تريس، SDS وDTT (التركيز النهائي: 50 mM تريس، 1٪ SDS، 50 mM DTT). يتم تشوهات البروتينات بكفاءة مباشرة بعد إذابة العينة ، من أجل تجنب التدهور غير المرغوب فيه عن طريق البروتياز النشط. وقد تم تحسين البروتوكول الأصلي FASP بزيادة حجم يغسل من 100 ميكرولتر إلى 200 ميكرولتر. وبهذه الطريقة، يتم تحقيق إزالة أفضل للمخلفات، وخاصة المنظفات من المرشح.
بعد الهضم الأنزيمي، وتقدير البروتين حسب المعيار الخارجي باستخدام LC-MS/MS سريع، يتم تنفيذ طريقة تعتمد على البيانات قبل الخطوات الأخيرة من البروتوكول، والتي تشمل تنقية StageTip مزدوجة وتحليل LC-MS/MS في وضع DIA، على مواد البدء المتساوية لجميع العينات (2 ميكروغرام).
ويرتبط براعة FASP مع نهج DIA، وهي طريقة حساسة توفير عدد قليل من القيم المفقودة17. في عملنا، تم تحديد 2387 بروتينا وقياسها كميا، مما مكن من رسم ملف تعريف بروتيومي مفصل لبول EPS. كان تحديد 2387 بروتينا وتحديدها كميا ممكنا من خلال إنشاء مكتبة طيفية غنية ، تم الحصول عليها عن طريق تجزئة الببتيدات ذات درجة الحموضة العالية ، وعن طريق طريقة DIA الخاصة بنا ، الموجهة إلى مجموعة واسعة من السلائف m / z. هذا سير العمل حددت أكثر من 80٪ من البروتينات الموجودة سابقا في التحليل المباشر EPS، مما يدل على أن جزءا كبيرا من البروتيوم EPS-البولية مشتق في الواقع من إفرازات البروستاتا أعرب، وبالتالي هو مصدر غني من البروتينات أنسجة البروستاتا محددة26.
في الختام، لدينا تصميم تجريبي الأزواج براعة FASP مع حساسية DIA من أجل الحصول على خريطة غنية من البروتيوم البولية. يوصى بهذه الاستراتيجية لتحليل عينات البول EPS، ولكن يمكن توسيع نطاق استخدامها إلى البروتيوميات البولية بشكل عام، أو حتى لأنواع العينات الأخرى.
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل من قبل MIUR (الوزير الجامعي Ricerca، PRIN 2017 إلى MG) وPOR كالابريا FESR 2014-2020، الإجراء 1.2.2، “INNOPROST”.
1 M Tris HCL pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
2-iodoacetamide for synthesis | Merck | 8047440100 | |
Acetonitrile for HPLC LC-MS grade | VWR | 83640.290 | |
Ammonium acetate | Fluka | 9690 | |
ammonium hydroxide solution | Sigma | 30501 | |
ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water | Merck | 318612-500ML | |
Dithiothreitol | Amresco | 0281-25G | |
Empore Cation 47mm Extraction Disks | Microcolumn | 2251 | |
Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
Formic acid optima | Fisher Scientific | A117-50 | |
Hela Protein Digest Standard | Fisher Scientific | 88329 | |
Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | MERCK | MRCPRT010 | |
sodium dodecyl sulfate solution | Merck | 71736-500ML | |
Thiethylammonium bicarbonate buffer | Merck | T7408-100ML | |
trifluoroacetic acid | Riedel-de Haën | 34957 | |
Trypsin from porcine pancreas | Merck | T6567-1MG | |
Urea | Merck | U6504-500G | |
Water HPLC gradient grade | Fisher Scientific | W/0106/17 | |
Proteome Discoverer 1,4 | Thermo Fisher Scientific | ||
Spectronaut 14.0 | Biognosys |