피브린이 풍부하고 tPA에 민감한 광혈전 뇌졸중 모델
概要
기존의 광혈전제 뇌졸중(PTS) 모델은 주로 조직 플라스미노겐 활성제(tPA) 용해 치료에 대한 내성이 높은 고밀도 혈소판 응집체를 유도합니다. 여기서 변형된 쥐 PTS 모델은 광활성화를 위해 트롬빈과 감광성 염료를 함께 주입하여 도입됩니다. 트롬빈 강화 PTS 모델은 혼합 혈소판:피브린 응고를 생성하며 tPA 혈전용해에 매우 민감합니다.
Abstract
이상적인 혈전색전증 뇌졸중 모델은 사망률이 낮은 비교적 간단한 수술 절차, 일관된 경색 크기 및 위치, 환자와 유사한 혈소판:피브린 혼합 혈전의 침전, 섬유소 용해 치료에 대한 적절한 민감성 등 특정 특성을 필요로 합니다. 로즈 벵골(RB) 염료 기반 광혈전 뇌졸중 모델은 처음 두 가지 요구 사항을 충족하지만 혈소판은 풍부하지만 피브린이 부족한 혈전 구성으로 인해 tPA 매개 용해 처리에 매우 내화성이 있습니다. 우리는 중뇌동맥(MCA)의 근위 가지를 겨냥한 광활성화를 위한 RB 염료(50mg/kg)와 트롬빈(80U/kg)의 혈전 미만 용량의 조합이 피브린이 풍부하고 tPA에 민감한 혈전을 생성할 수 있다고 추론합니다. 실제로, 트롬빈과 RB(T+RB)의 결합 광혈전증 모델은 면역염색 및 면역블롯에서 볼 수 있듯이 혼합혈소판:피브린 혈전을 유발하고 일관된 경색 크기와 위치와 낮은 사망률을 유지했습니다. 또한, 광활성화 후 2시간 이내에 tPA(Alteplase, 10mg/kg)를 정맥 주사하면 T+RB 광혈전증의 경색 크기가 유의하게 감소했습니다. 따라서, 트롬빈-강화 광혈전 뇌졸중 모델은 새로운 혈전용해 요법을 시험하기 위한 유용한 실험 모델이 될 수 있다.
Introduction
혈관 내 혈전제거술과 tPA 매개 혈전용해술은 미국 식품의약국(FDA)이 승인한 급성 허혈성 뇌졸중 치료법 중 유일하게 두 가지로, 미국에서 매년 ~700,000명의 환자를 괴롭히고 있습니다1. 혈전절제술은 대혈관 폐색(LVO)으로 제한되기 때문에 tPA 혈전용해술은 소혈관 폐색을 완화할 수 있지만, 둘 다 급성 허혈성 뇌졸중의 중요한 치료법이다2. 또한, 두 치료법의 조합(예: 뇌졸중 발병 후 4.5시간 이내에 tPA-혈전용해술을 시작한 후 혈전절제술을 시행)은 재관류와 기능적 결과를 개선한다3. 따라서 혈전용해술을 최적화하는 것은 혈전제거술의 시대에도 뇌졸중 연구의 중요한 목표로 남아 있습니다.
혈전색전증 모델은 혈전용해 요법을 개선하는 것을 목표로 하는 전임상 뇌졸중 연구에 필수적인 도구입니다. 이는 기계적 혈관 폐색 모델(예: 내강 내 봉합사 MCA 폐색)은 혈전을 생성하지 않으며, 기계적 폐색 제거 후 대뇌 혈류의 빠른 회복이 지나치게 이상화되어 있기 때문이다 4,5. 현재까지 주요 혈전색전증 모델에는 광혈 전증 6,7,8, 국소 염화제2철(FeCl3) 적용9, MCA 분지(10,11)로의 트롬빈 미세주입, MCA 또는 총경동맥(CCA)에 체외(미세)색전증 주입(CCA)12,13,14 및 일과성 저산소증-허혈(tHI)15,16, 17,18. 이러한 뇌졸중 모델은 혈전의 조직학적 조성과 tPA 매개 용해 요법에 대한 민감도가 다릅니다(표 1). 또한 개두술의 외과적 요구 사항(제자리 트롬빈 주사 및 FeCl3의 국소 적용에 필요), 경색 크기 및 위치의 일관성(예: 미세색전의 CCA 주입은 매우 다양한 결과를 산출함) 및 심혈관계에 대한 전반적인 효과(예: tHI는 저산소증으로 인한 말초 혈관 확장을 보상하기 위해 심박수 및 심박출량을 증가시킴)에 따라 다릅니다.
RB 염료 기반 광혈전 뇌졸중(PTS) 모델은 개두술이 필요 없는 간단한 수술 절차, 낮은 사망률(일반적으로 < 5%), 예측 가능한 경색의 크기 및 위치(MCA 공급 영역에서) 등 많은 매력적인 기능을 가지고 있지만 두 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 8 첫 번째 주의 사항은 tPA 매개 혈전용해 치료에 대한 반응이 약하거나 전무하다는 것인데, 이는 FeCl3 모델 7,19,20의 단점이기도 합니다. PTS 및 FeCl3 뇌졸중 모델의 두 번째 주의 사항은 이어지는 혈전이 소량의 피브린과 함께 조밀하게 포장된 혈소판 응집체로 구성되어 있어 tPA 용해 요법에 대한 회복력을 유발할 뿐만 아니라 급성 허혈성 뇌졸중 환자에서 혼합된 혈소판:피브린 혈전의 패턴에서 벗어난다는 것입니다21,22. 대조적으로, 제자리 트롬빈-미세주사 모델은 주로 중합된 피브린과 불확실한 혈소판 함량을 포함한다(10).
위와 같은 추론을 감안할 때, 얇아진 두개골을 통한 MCA 표적 광활성화를 위해 RB와 트롬빈의 아혈전 용량을 혼합하면 결과 혈전의 피브린 성분이 증가하고 tPA 매개 용해 치료에 대한 민감도가 높아질 수 있다는 가설을 세웠습니다. 우리는 이 가설을 확인했으며,23 여기에서 변형된(T+RB) 광혈전 뇌졸중 모델의 세부 절차를 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
1985년에 도입된 전통적인 RB 광혈전 뇌졸중은 간단한 수술 절차, 낮은 사망률 및 높은 뇌경색 재현성을 위한 국소 뇌허혈의 매력적인 모델입니다. 5 이 모델에서, 광역학적 염료 RB는 광 여기시 혈소판을 빠르게 활성화하여 혈관을 막는 조밀 한 응집체를 유도합니다 5,8,23. 그러나, RB 유도 혈전 내 소량의 피브린…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH 보조금(NS108763, NS100419, NS095064 및 HD080429 C.Y. K.; 및 NS106592 Y.Y.S.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Meloxicam SR | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
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