概要

Un modèle d’AVC photothrombotique enrichi en fibrine et sensible au tPA

Published: June 04, 2021
doi:

概要

Les modèles traditionnels d’AVC photothrombotique (PTS) induisent principalement des agrégats plaquettaires denses d’une haute résistance au traitement lytique par activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Ici, un modèle PTS murin modifié est introduit en co-injectant de la thrombine et un colorant photosensible pour la photoactivation. Le modèle PTS amélioré par la thrombine produit des caillots mixtes plaquettaire/fibrine et est très sensible à la thrombolyse tPA.

Abstract

Un modèle idéal d’AVC thromboembolique nécessite certaines propriétés, notamment des procédures chirurgicales relativement simples avec une faible mortalité, une taille et une localisation d’infarctus constantes, une précipitation de caillots sanguins mélangés plaquettaire/fibrine similaires à ceux des patients, et une sensibilité adéquate au traitement fibrinolytique. Le modèle d’AVC photothrombotique à base de colorant rose bengale (RB) répond aux deux premières exigences, mais est hautement réfractaire au traitement lytique médié par le tPA, probablement en raison de sa composition en caillots riche en plaquettes, mais pauvre en fibrine. Nous pensons que la combinaison d’un colorant RB (50 mg/kg) et d’une dose sub-thrombotique de thrombine (80 U/kg) pour la photoactivation visant la branche proximale de l’artère cérébrale moyenne (MCA) peut produire des caillots enrichis en fibrine et sensibles au tPA. En effet, le modèle de photothrombose combinée à la thrombine et à la RB (T+RB) a déclenché des caillots sanguins mixtes plaquette/fibrine, comme le montrent l’immunomarquage et les immunoblots, et a maintenu des tailles et des emplacements d’infarctus constants ainsi qu’une faible mortalité. De plus, l’injection intraveineuse de tPA (Alteplase, 10 mg/kg) dans les 2 heures suivant la photoactivation a significativement diminué la taille de l’infarctus dans la photothrombose T+RB. Ainsi, le modèle d’AVC photothrombotique amélioré par la thrombine peut être un modèle expérimental utile pour tester de nouvelles thérapies thrombolytiques.

Introduction

La thrombectomie endovasculaire et la thrombolyse médiée par tPA sont les deux seules thérapies approuvées par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour l’AVC ischémique aigu, qui touche ~700 000 patients chaque année aux États-Unis1. Étant donné que l’application de la thrombectomie est limitée à l’occlusion des gros vaisseaux (LVO), alors que la thrombolyse tPA peut soulager les occlusions des petits vaisseaux, les deux sont des thérapies précieuses de l’AVC ischémique aigu2. De plus, la combinaison des deux thérapies (p. ex., l’initiation de la thrombolyse tPA dans les 4,5 heures suivant le début de l’AVC, suivie d’une thrombectomie) améliore la reperfusion et les résultats fonctionnels3. Ainsi, l’optimisation de la thrombolyse reste un objectif important pour la recherche sur l’AVC, même à l’ère de la thrombectomie.

Les modèles thromboemboliques sont un outil essentiel pour la recherche préclinique sur l’AVC visant à améliorer les thérapies thrombolytiques. Cela est dû au fait que les modèles d’occlusion vasculaire mécanique (par exemple, l’occlusion MCA de suture intraluminale) ne produisent pas de caillots sanguins et que la récupération rapide du flux sanguin cérébral après l’ablation de l’occlusion mécanique est trop idéalisée 4,5. À ce jour, les principaux modèles thromboemboliques comprennent la photothrombose 6,7,8, l’application topique de chlorure ferrique (FeCl3)9, la micro-injection de thrombine dans la branche MCA 10,11, l’injection ex vivo de (micro)emboles dans le MCA ou l’artère carotide commune (ACC)12,13,14 et l’hypoxie-ischémie transitoire (tHI)15,16, Chapitre 17 et 18. Ces modèles d’AVC diffèrent par la composition histologique des caillots qui en résultent et la sensibilité aux thérapies lytiques médiées par le tPA (tableau 1). Ils varient également en ce qui concerne l’exigence chirurgicale de la craniotomie (nécessaire pour l’injection in situ de thrombine et l’application topique de FeCl3), la constance de la taille et de la localisation de l’infarctus (par exemple, la perfusion d’ACC de microemboles donne des résultats très variables) et les effets globaux sur le système cardiovasculaire (par exemple, l’IHI augmente la fréquence cardiaque et le débit cardiaque pour compenser la vasodilatation périphérique induite par l’hypoxie).

Le modèle d’AVC photothrombotique (PTS) basé sur le colorant RB présente de nombreuses caractéristiques intéressantes, notamment des procédures chirurgicales simples sans craniotomie, une faible mortalité (généralement < 5 %) et une taille et une localisation prévisibles de l’infarctus (dans le territoire fournissant l’ACM), mais il présente deux limites majeures. 8 La première mise en garde est la réponse faible à nulle au traitement thrombolytique médié par le tPA, ce qui est également un inconvénient du modèle FeCl3 7,19,20. La deuxième mise en garde des modèles d’AVC PTS et FeCl3 est que les thrombus qui en résultent sont constitués d’agrégats plaquettaires densément emballés avec une petite quantité de fibrine, ce qui non seulement conduit à sa résilience au traitement tPA-lytique, mais s’écarte également du modèle de thrombus plaquettaire/fibrine mélangés chez les patients ayant subi un AVC ischémique aigu21,22. En revanche, le modèle de thrombine-microinjection in situ comprend principalement de la fibrine polymérisée et une teneur incertaine en plaquettes10.

Compte tenu du raisonnement ci-dessus, nous avons émis l’hypothèse que l’association de RB et d’une dose sous-thrombotique de thrombine pour la photoactivation ciblée par l’ACM à travers un crâne aminci peut augmenter la composante fibrine dans les thrombus résultants et augmenter la sensibilité au traitement lytique médié par tPA. Nous avons confirmé cette hypothèse23 et nous décrivons ici en détail les procédures du modèle d’AVC photothrombotique modifié (T+RB).

Protocol

Ce protocole est approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Virginie et suit les lignes directrices des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. La figure 1A décrit la séquence des interventions chirurgicales de ce protocole. 1. Configuration de la chirurgie Placez un coussin chauffant avec une température réglée à 37 °C sur l’adaptateur pour petit …

Representative Results

Tout d’abord, nous avons comparé la teneur en fibrine dans les caillots sanguins induits par la photothrombose RB par rapport à T+RB. Des souris ont été sacrifiées par perfusion transcardique de fixateurs 2 h après la photoactivation, et des cerveaux ont été prélevés pour la coloration par immunofluorescence de la branche MCA dans les plans longitudinaux et transversaux. Dans la photothrombose RB, la branche MCA était densément remplie de plaquettes CD41+ et de peu de fibrine (<strong class="xfig…

Discussion

L’AVC photothrombotique RB traditionnel, introduit en 1985, est un modèle attrayant d’ischémie cérébrale focale pour les interventions chirurgicales simples, la faible mortalité et la reproductibilité élevée de l’infarctus cérébral. 5 Dans ce modèle, le colorant photodynamique RB active rapidement les plaquettes lors de l’excitation lumineuse, conduisant à des agrégats denses qui occlus le vaisseau sanguin 5,8,23.<sup …

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par les subventions du NIH (NS108763, NS100419, NS095064 et HD080429 à C.Y.K. ; et NS106592 à Y.Y.S.).

Materials

2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma T8877 infarct
4-0 Nylon monofilament suture LOOK 766B surgical supplies
5-0 silk suture Harvard Apparatus 624143 surgical supplies
543nm laser beam Melles Griot 25-LGP-193-249 photothrombosis
adult male mice Charles River C57BL/6 10~14 weeks old (22~30 g)
Anesthesia bar for mouse adaptor machine shop, UVA surgical setup
Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) Sigma T48402 euthanasia
Dental drill Dentamerica Rotex 782 surgical setup
Digital microscope Dino-Lite AM2111 brain imaging
Dissecting microscope Olympus SZ40 surgical setup
Fine curved forceps (serrated) FST 11370-31 surgical instrument
Fine curved forceps (smooth) FST 11373-12 surgical instrument
goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 Invitrogen A11008 Immunohistochemistry
Halsted-Mosquito hemostats FST 13008-12 surgical instrument
Heat pump with warming pad Gaymar TP700 surgical setup
infusion pump KD Scientific 200 thrombolytic treatment
Insulin syringe with 31G needle BD 328291 photothrombosis
Ketamine CCM, UVA anesthesia
Laser protective google 532nm Thorlabs LG3 photothrombosis
Meloxicam SR CCM, UVA NSAID analgesia
micro needle holders FST 12060-01 surgical instrument
micro scissors FST 15000-03 surgical instrument
MoorFLPI-2 blood flow imager Moor 780-nm laser source Laser Speckle Contrast Imaging
Mouse adaptor RWD 68014 surgical setup
Puralube Vet ointment Fisher NC0138063 eye dryness prevention
Retractor tips Kent Scientific Surgi-5014-2 surgical setup
Rose Bengal Sigma 198250 photothrombosis
Thrombin Sigma T7513 photothrombosis
Tissue glue Abbott Laboratories NC9855218 surgical supplies
tPA Genetech Cathflo activase 2mg thrombolytic treatment
Vibratome Stoelting 51425 TTC infacrt
Xylazine CCM, UVA anesthesia

参考文献

  1. Lyden, P. D. . Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).
  2. Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
  3. Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
  4. Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
  5. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  6. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
  7. Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
  8. Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
  9. Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
  10. Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
  11. Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
  12. Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
  13. Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
  14. Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
  15. Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
  16. Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
  17. Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
  18. Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
  19. Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
  20. Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
  21. Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
  22. Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
  23. Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
  24. Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
  25. Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
  26. Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
  27. Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
  28. McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
  29. Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
  30. Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).

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記事を引用
Kuo, Y., Sun, Y., Kuan, C. A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model. J. Vis. Exp. (172), e61740, doi:10.3791/61740 (2021).

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