L’étiquetage isotopique combiné des précurseurs et le marquage isobarique (cPILOT) est une stratégie améliorée de multiplexage d’échantillons qui est capable d’augmenter le nombre d’échantillons qui peuvent être analysés simultanément avec les étiquettes isobariques disponibles. L’incorporation d’une plate-forme robotique a considérablement augmenté le débit expérimental, la reproductibilité et la précision quantitative.
Nous avons introduit un flux de travail protéomique quantitatif à haut débit, un étiquetage isotopique combiné précurseur et un marquage isobarique (cPILOT) capable de multiplexer jusqu’à 22 ou 24 échantillons avec des étiquettes de masse tandem ou n isobarique, des étiquettes isobariques de leucine de N-dimethyl, respectivement, dans une seule expérience. Ce multiplexage d’échantillons amélioré réduit considérablement les temps d’acquisition de spectrométrie de masse et augmente l’utilité des reagents isobariques commerciaux coûteux. Toutefois, le processus manuel des étapes de manipulation et de pipetage de l’échantillon dans la stratégie peut être laborieux, long, et introduire la perte d’échantillon et l’erreur quantitative. Ces limitations peuvent être surmontées par l’incorporation de l’automatisation. Ici, nous avons transféré le protocole cPILOT manuel à un dispositif automatisé de manutention des liquides qui peut préparer de grands nombres d’échantillons (c.-à-d. 96 échantillons) en parallèle. Dans l’ensemble, l’automatisation augmente la faisabilité et la reproductibilité du cPILOT et permet une large utilisation par d’autres chercheurs avec des dispositifs d’automatisation comparables.
La protéomique basée sur la spectrométrie de masse (SP) est un outil de recherche indispensable pour identifier les biomarqueurs spécifiques à la maladie, comprendre la progression de la maladie et créer des pistes de développement thérapeutique. Ceci peut être réalisé à partir d’une gamme d’échantillons cliniques liés à la maladie tels que le sérum sanguin/plasma, les fluides proximaux, et lestissus 1,2. La découverte et la validation des biomarqueurs protéomiques ont récemment été prises en considération en raison de la puissance des stratégies de multiplexagede l’échantillon 3,4. Le multiplexage d’échantillon est une technique qui permet la comparaison et la quantification simultanées de deux conditions d’échantillon ou plus dans une seule injectionde SP 5,6. Le multiplexage de l’échantillon est réalisé en codant à barres des peptides ou des protéines à partir de plusieurs échantillons avec des étiquettes chimiques, enzymatiques ou métaboliques et en obtenant de l’information sur la SP à partir de tous les échantillons dans le cas d’une seule expérience de SP ou de SP/SP. Parmi les étiquettes isobariques disponibles figurent des reagents de marquage isobarique (iTRAQ), des étiquettes de masse en tandem commercial (TMT) et des réaccéléments isobariques synthétisés maison N, N-dimethyl leucine (DiLeu) avec des capacités jusqu’à 16-plex7 et 21-plex8,respectivement.
L’étiquetage isotopique combiné des précurseurs et le marquage isobarique (cPILOT) est une technologie améliorée de multiplexage d’échantillons. cPILOT combine l’étiquetage isotopique du peptide N-termini avec des isotopes légers [−(CH3)2]et lourds [−(13C2H3)2] isotopes à faible pH (∼2,5), ce qui maintient les résidus de lysine disponibles pour l’étiquetage isobarique élevé subséquent (8,5) à l’aide de TMT, DiLeu, ou iTRAQ marquage3,9,10,11,12,13,14. Le système d’étiquetage double de la stratégie cPILOT est représenté dans la figure supplémentaire 1 avec deux échantillons utilisant un exemple de peptide. La précision et la précision de la quantification basée sur le TMT au niveau MS2 peuvent être compromises en raison de la présence d’ions co-isolés et co fragmentés appelé l’effet d’interférence15. Cette limitation des ratios d’ion de reporter inexacts peut être surmontée à l’aide de spectromètres de masse Tribrid Orbitrap. Par exemple, l’effet d’interférence peut être surmonté en isolant un pic dans une paire dimethylated au niveau MS1 dans le spectromètre de masse, en soumettant le pic léger ou lourd à la fragmentation de MS2 dans le piège à ions linéaire, puis en soumettant le fragment ms2 le plus intense pour HCD-MS3 pour obtenir des informations quantitatives. Afin d’augmenter les chances de sélection des peptides sans lysine amines disponibles pour générer des ions reporter, une acquisition sélective ms3 basée sur le fragment y-1 peut également être utilisé et est une approche qui peut entraîner un pourcentage plus élevé de peptides quantifiables avec cPILOT9. La combinaison de l’étiquetage léger et lourd augmente les capacités de multiplexage de l’échantillon par un facteur de 2x à celui obtenu avec les étiquettes isobariques individuelles. Nous avons récemment utilisé cPILOT pour combiner jusqu’à 24 échantillons en une seule expérience avec les reagents DiLeu16. En outre, cPILOT a été utilisé pour étudier les modifications oxydatives post-translationnelles14, y compris la nitrationprotéique 17, d’autres protéomesmondiaux 9, et a démontré des applications à travers plusieurs échantillons de tissus dans un modèle de souris de la maladie d’Alzheimer11.
La préparation robuste de l’échantillon est une étape critique d’une expérience cPILOT et peut prendre beaucoup de temps, être laborieuse et étendue. Le multiplexage amélioré d’échantillon exige le pipetting étendu et le personnel de laboratoire hautement qualifié, et il y a plusieurs facteurs qui peuvent fortement influencer la reproductibilité de l’expérience. Par exemple, une manipulation minutieuse des échantillons est nécessaire pour assurer des temps de réaction similaires pour tous les échantillons et pour maintenir un pH tampon approprié pour les échantillons légers et lourds dimethylated. En outre, la préparation manuelle de dizaines à des centaines d’échantillons peut introduire une erreur expérimentale élevée. Par conséquent, afin de réduire la variabilité de la préparation des échantillons, d’améliorer la précision quantitative et d’augmenter le débit expérimental, nous avons mis au point un flux de travail automatisé du CPILOT. L’automatisation se fait à l’aide d’un dispositif robotique de manipulation des liquides qui peut compléter de nombreux aspects du flux de travail( Figure 1). La préparation de l’échantillon, de la quantification des protéines à l’étiquetage peptidique, a été effectuée sur un gestionnaire de liquide automatisé. Le gestionnaire de liquide automatisé est intégré à un appareil à pression positive (PPA) pour les échanges tampons entre les plaques d’extraction à phase solide (SPE), le shaker orbital et un dispositif de chauffage/refroidissement. La plate-forme robotique contient 28 emplacements de pont pour accueillir des plaques et des tampons. Il y a deux gousses avec une pince pour transférer les plaques à l’intérieur des emplacements du pont : une tête de pipetage à volume fixe à 96 canaux (5-1100 μL) et 8 sondes à volume variable de canal (1-1000 μL). La plate-forme robotique est contrôlée à l’aide d’un logiciel. L’utilisateur doit être formé professionnellement avant d’utiliser le gestionnaire de liquide robotique. La présente étude se concentre sur l’automatisation du flux de travail manuel cPILOT, qui peut être à forte intensité de main-d’œuvre pour le traitement de plus de 12 échantillons en un seul lot. Afin d’augmenter le débit de l’approche cPILOT11, nous avons transféré le protocole cPILOT à un gestionnaire de liquide robotique pour traiter plus de 10 échantillons en parallèle. L’automatisation permet également des réactions similaires pour chaque échantillon en parallèle au cours des différentes étapes du processus de préparation de l’échantillon, ce qui a nécessité des utilisateurs hautement qualifiés à réaliser pendant le cPILOT manuel. Ce protocole se concentre sur la mise en œuvre du dispositif automatisé de manutention des liquides pour effectuer cPILOT. La présente étude décrit le protocole d’utilisation de ce système automatisé et démontre ses performances à l’aide d’une analyse « preuve de concept » de 22 plex des homogénéisations hépatiques de souris.
cPILOT est une stratégie de multiplexage améliorée qui peut analyser jusqu’à 24 échantillons en une seule expérience. La capacité de multiplexage dépend du nombre de combinaisons de marquage isotopiques et isobariques disponibles. L’introduction du TMTpro7, qui est capable d’étiqueter 16 échantillons en une seule expérience, peut repousser les limites du cPILOT à 32-plex. cPILOT se compose de plusieurs étapes de pipetage et nécessite des soins approfondis et des compétences de l’utilisateur pour effectuer la préparation de l’échantillon. Même avec un utilisateur expert, les erreurs manuelles sont inévitables, ce qui invite l’utilisation de plates-formes robotiques pour traiter des échantillons dans la stratégie cPILOT. Étant donné que cPILOT utilise le marquage dépendant du pH des peptides, le pH doit être maintenu pour la lumière et l’ensemble lourd d’échantillons dimethylated. Le pH légèrement acide-basique peut avoir comme conséquence la diméthylation des résidus de N-termini et de lysine. Un avantage du cPILOT est qu’il ne nécessite que la moitié des étiquettes isobariques puisque le peptide N-termini sont occupés avec les groupes de diméthyle. Cela permet un plus grand nombre d’échantillons d’être étiquetés à la moitié du coût. La manipulation de plus grands nombres d’échantillons exige que les temps d’exposition des reagents soient similaires pour le premier et le dernier échantillon d’un lot. Un distributeur de pipette pouvant accueillir jusqu’à 32 échantillons en parallèle peut être réalisé avec l’utilisation de dispositifs robotiques de manutention des liquides.
Afin de traiter plusieurs échantillons par cPILOT, le workflow manuel a été modifié pour intégrer l’automatisation. Le gestionnaire de liquide robotique utilisé dans cette étude a deux gousses avec des capacités de pipetage à 96 canaux et à 8 canaux, avec une pince pour placer les plaques dans les 28 emplacements de pont disponibles. Le gestionnaire liquide est intégré à un appareil à pression positive, shaker orbital, et un dispositif pour chauffer / refroidir les échantillons dans la plaque de puits 96. L’appareil à pression positive aide à effectuer des échanges tampons dans les plaques SPE pendant le nettoyage, tandis que le shaker orbital aide à vortex / mélanger les échantillons. La plate-forme robotique a été programmée pour aspirer et distribuer des tampons et des échantillons à des plaques de 96 puits, à l’incubation, à des échantillons de vortex et à des plaques de transfert. Les liquides avec des viscosités différentes, telles que l’acétylonitrile et l’eau, nécessitent des considérations spécifiques de pipetting qui peuvent également être programmées dans la méthode.
Le flux de travail cPILOT, à partir de la quantification des protéines par BCA à l’étiquetage des peptides à l’aide d’étiquettes isobariques (c.-à-d. TMT), a été effectué sur le système de manutention liquide. Le protocole complet a été mis à l’échelle pour utiliser 96 plaques de puits profonds qui peuvent contenir 2 mL par puits. Les tampons ont été préparés avant le début de l’expérience et ajoutés à la plaque de puits 96 afin de permettre le traitement parallèle de l’échantillon. Dans la présente étude, 22 répliques de flux de travail de l’homogénéité du foie de souris ont été ajoutées aux plaques profondes du puits et prises par le protocole cPILOT. Enfin, un seul échantillon composé des peptides marqués par le foie de souris équimolar de 22 plex a été injecté au spectromètre de masse. Les intensités d’ion de reporter correspondant à l’abondance de peptide dans les échantillons ont démontré que les échantillons traités avec le gestionnaire liquide ont des CV inférieurs au protocole manuel(données non montrées). La plate-forme robotique a également grandement amélioré la reproductibilité du traitement des échantillons. La reproductibilité et la robustesse sont des facteurs très importants lors du traitement d’un grand nombre d’échantillons. Les erreurs de pipetage peuvent conduire à une mauvaise interprétation complète des données et ici la plate-forme robotique a fourni une faible variation inter-échantillon. L’utilisation de la plate-forme robotique pour le cPILOT a également réduit le temps nécessaire à la préparation des échantillons. Par exemple, après avoir développé la méthode automatisée, il a fallu 2,5 h pour traiter 22 échantillons contre 7,5 h pour le cPILOT manuel. Des expériences sont en cours dans notre laboratoire pour évaluer davantage les comparaisons des workflows manuels et automatisés du CPILOT. D’après les rapports précédents de notre laboratoire, les taux d’intensité des ions de reporter de protéines dans le cPILOT manuel étaient en moyenne de 20 %, certaines valeurs aberrantes dépassantcette valeur 12.
cPILOT est une stratégie de dérivation chimique au niveau du peptide, qui peut être utilisée pour n’importe quel type d’échantillon comme les cellules, les tissus et les liquides organiques. cPILOT offre un multiplexage d’échantillons amélioré et avec l’incorporation de l’automatisation peut faciliter le multiplexage d’échantillons à haut débit dans la protéomique. Ce débit est nécessaire pour faire progresser la compréhension de la maladie et de la biologique et la découverte de biomarqueurs.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs reconnaissent les fonds de démarrage de l’Université Vanderbilt et le prix NIH (R01GM117191) à RASR.
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
Tris | Biorad | 161-0716 | |
Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
Urea | Biorad | 161-0731 | |
Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |