A rotulagem isotópica precursora combinada e a marcação isobárica (cPILOT) é uma estratégia de multiplexação de amostra aprimorada que é capaz de aumentar o número de amostras que podem ser analisadas simultaneamente com tags isobáricas disponíveis. A incorporação de uma plataforma robótica aumentou consideravelmente o rendimento experimental, a reprodutibilidade e a precisão quantitativa.
Introduzimos um fluxo de trabalho de proteômica quantitativa de alto rendimento, rotulagem isotópica precursora combinada e marcação isobárica (cPILOT) capaz de multiplexar até 22 ou 24 amostras com etiquetas de massa tandem ou etiquetas isobáricas N,N-dimethyl leucina isobaric, respectivamente, em um único experimento. Este multiplexagem de amostra aprimorado reduz consideravelmente os tempos de aquisição de espectrometria de massa e aumenta a utilidade dos reagentes isobáicos comerciais caros. No entanto, o processo manual de manuseio de amostras e etapas de pipetação na estratégia pode ser trabalhoso, demorado e introduzir perda de amostra e erro quantitativo. Essas limitações podem ser superadas através da incorporação da automação. Aqui transferimos o protocolo manual cPILOT para um dispositivo de manuseio líquido automatizado que pode preparar grandes números de amostra (ou seja, 96 amostras) em paralelo. No geral, a automação aumenta a viabilidade e a reprodutibilidade do cPILOT e permite um amplo uso por outros pesquisadores com dispositivos de automação comparáveis.
A espectrometria de massa (mS) é uma ferramenta de pesquisa indispensável na identificação de biomarcadores específicos da doença, na compreensão da progressão da doença e na criação de leads para o desenvolvimento terapêutico. Isso pode ser obtido a partir de uma série de amostras clínicas relacionadas à doença, como soro/plasma sanguíneo, fluidos proximais e tecidos1,2. A descoberta e validação de biomarcadores de proteômica ganharam recentemente significativa consideração devido ao poder das estratégias de multiplexação da amostra3,4. Multiplexação amostral é uma técnica que permite a comparação simultânea e quantificação de duas ou mais condições amostrais dentro de uma única injeção de MS5,6. O multiplexing amostral é obtido através de peptídeos de barcodificação ou proteínas de múltiplas amostras com marcas químicas, enzimáticas ou metabólicas e obtenção de informações de MS de todas as amostras em um único experimento em MS ou MS/MS. Entre as etiquetas isobáricas disponíveis estão reagentes isobáicos de marcação (iTRAQ), tags de massa tandem comercial (TMT) e em casa sintetizados reagentes isobáricos N,N-dimethyl leucina (DiLeu) com capacidades de até 16-plex7 e 21-plex8, respectivamente.
A rotulagem isotópica precursora combinada e a marcação isobárica (cPILOT) é uma tecnologia de multiplexação de amostra aprimorada. cPILOT combina rotulagem isotópica de peptídeo N-termini com leve [-(CH3)2] e pesado [−(13C2H3)2] isótopos em pH baixo (∼2,5), que mantém o resíduo de liseina disponível para rotulagem isobárica de pH (8,5) DiLeu, ou iTRAQ marcando3,9,10,11,12,13,14. O esquema de rotulagem dupla da estratégia cPILOT é retratado na Figura Suplementar 1 com duas amostras usando um peptídeo de exemplo. A precisão e precisão da quantificação baseada em TMT no nível MS2 pode ser comprometida devido à presença de íons co-isolados e co-fragmentados considerados como efeito de interferência15. Essa limitação em proporções de íons de repórter imprecisas pode ser superada com a ajuda de espectrômetros de massa tribrid Orbitrap. Por exemplo, o efeito de interferência pode ser superado isolando um pico em um par dimetilado no nível MS1 no espectrômetro de massa, submetendo o pico leve ou pesado à fragmentação de MS2 na armadilha de íons lineares e, em seguida, submetendo o fragmento mais intenso de MS2 para HCD-MS3 para obter informações quantitativas. A fim de aumentar as chances de seleção dos peptídeos sem aminas de liseina disponíveis para geração de íons repórteres, uma aquisição seletiva de MS3 com base no fragmento y-1 também pode ser usada e é uma abordagem que pode resultar em uma maior porcentagem de peptídeos quantificáveis com cPILOT9. A combinação de rotulagem leve e pesada aumenta as capacidades de multiplexação da amostra em um fator de 2x ao alcançado com tags isobáricas individuais. Recentemente, usamos o cPILOT para combinar até 24 amostras em um único experimento com reagentes DiLeu16. Além disso, o cPILOT tem sido usado para estudar modificações oxidativas pós-translacionais14, incluindo nitração proteica17, outros proteomes globais9, e demonstrou aplicações em várias amostras de tecido em um modelo de camundongo da doença de Alzheimer11.
A preparação robusta da amostra é um passo crítico em um experimento cPILOT e pode ser demorado, trabalhoso e extenso. Multiplexing de amostra aprimorado requer tubulação extensiva e pessoal de laboratório altamente qualificado, e há vários fatores que podem influenciar fortemente a reprodutibilidade do experimento. Por exemplo, o manuseio cuidadoso das amostras é necessário para garantir tempos de reação semelhantes para todas as amostras e manter o pH tampão adequado para amostras fracastiladas leves e pesadas. Além disso, a preparação manual de dezenas a centenas de amostras pode introduzir um alto erro experimental. Portanto, para reduzir a variabilidade de preparação da amostra, melhorar a precisão quantitativa e aumentar o throughput experimental, desenvolvemos um fluxo de trabalho automatizado cPILOT. A automação é alcançada utilizando um dispositivo de manuseio líquido robótico que pode completar muitos aspectos do fluxo de trabalho (Figura 1). A preparação da amostra da quantificação proteica para a rotulagem de peptídeos foi realizada em um manipulador líquido automatizado. O manipulador líquido automatizado é integrado a um aparelho de pressão positivo (PPA) para trocas de buffer entre as placas de extração em fase sólida (SPE), shaker orbital e um dispositivo de aquecimento/resfriamento. A plataforma robótica contém 28 locais de deck para acomodar placas e buffers. Existem dois pods com um gripper para transferir as placas dentro dos locais do convés: uma cabeça de tubulação de volume fixo de 96 canais (5-1100 μL) e sondas de volume variável de 8 canais (1-1000 μL). A plataforma robótica é controlada usando um software. O usuário precisa ser treinado profissionalmente antes de usar o manipulador líquido robótico. O presente estudo se concentra na automatização do fluxo de trabalho manual cPILOT, que pode ser intensivo em mão-de-obra para o processamento de mais de 12 amostras em um único lote. A fim de aumentar o rendimento da abordagem cPILOT11,transferimos o protocolo cPILOT para um manipulador líquido robótico para processar mais de 10 amostras em paralelo. A automação também permite reações semelhantes para cada amostra em paralelo durante várias etapas do processo de preparação da amostra, o que exigiu que usuários altamente treinados alcançassem durante o CPILOT manual. Este protocolo se concentra na implementação do dispositivo de manuseio líquido automatizado para realizar o cPILOT. O presente estudo descreve o protocolo para o uso deste sistema automatizado e demonstra seu desempenho usando uma análise de 22 plex “prova de conceito” de homogeneizadores hepáticos de camundongos.
cPILOT é uma estratégia de multiplexação aprimorada que pode analisar até 24 amostras em um único experimento. A capacidade de multiplexing depende do número de combinações isotópicas e isobáricas disponíveis. A introdução do TMTpro7, que é capaz de marcar 16 amostras em um único experimento, pode empurrar os limites do cPILOT para 32-plex. cPILOT consiste em múltiplas etapas de pipetação e requer cuidados extensivos e habilidades do usuário para realizar a preparação da amostra. Mesmo com um usuário especialista, erros manuais são inevitáveis, o que convida o uso de plataformas robóticas para processar amostras na estratégia cPILOT. Uma vez que o cPILOT utiliza a marcação dependente de pH dos peptídeos, o pH precisa ser mantido para a luz e o conjunto de amostras estilizadas pesadas. PH levemente ácido-básico pode resultar em dimetilação tanto de resíduos de N-termini quanto de lisina. Uma vantagem do cPILOT é que ele requer apenas metade das tags isobáricas, uma vez que peptídeo N-termini são ocupados com os grupos de dimetila. Isso permite que um número maior de amostras seja rotulada pela metade do custo. O manuseio de números amostrais maiores requer que os tempos de exposição ao reagente sejam semelhantes para a primeira e a última amostra em um lote. Um distribuidor de pipetas que pode acomodar até 32 amostras em paralelo pode ser melhor alcançado com o uso de dispositivos robóticos de manuseio líquido.
Para processar várias amostras por cPILOT, o fluxo de trabalho manual foi alterado para incorporar a automação. O manipulador líquido robótico usado neste estudo possui dois pods com habilidades de pipetação de 96 canais e 8 canais, com uma pinça para colocar as placas nos 28 locais disponíveis. O manipulador líquido é integrado com um aparelho de pressão positivo, shaker orbital e um dispositivo para aquecer/resfriar amostras na placa de 96 poços. O aparelho de pressão positiva auxilia na realização de trocas tampão nas placas de SPE durante a limpeza, enquanto o agitador orbital ajuda a vórtice/misturar as amostras. A plataforma robótica foi programada para aspirar e distribuir tampões e amostras para placas de 96 poços, incubar, amostras de vórtice e placas de transferência. Líquidos com diferentes viscosidades, como acetonitrilo e água, requerem considerações específicas de pipetização que também podem ser programadas no método.
O fluxo de trabalho cPILOT, desde a quantificação proteica pelo BCA até a rotulagem dos peptídeos com tags isobáricas (ou seja, TMT), foi realizado no sistema de manipuladores líquidos. O protocolo completo foi dimensionado para usar 96 placas de poços profundos que podem conter 2 mL por poço. Os buffers foram preparados antes do início do experimento e adicionados à placa do poço 96, de modo a permitir o processamento paralelo da amostra. No presente estudo, 22 réplicas do fluxo de trabalho do homogeneato do fígado do camundongo foram adicionadas às placas profundas do poço e levadas através do protocolo cPILOT. Finalmente, uma única amostra constituída pelo fígado de rato equimolar de 22 plex foi injetada no espectrômetro de massa. Intensidades de íons repórteres correspondentes à abundância de peptídeos nas amostras demonstraram que as amostras processadas com o manipulador líquido têm CVs menores do que o protocolo manual(dados não mostrados). A plataforma robótica também melhorou muito a reprodutibilidade do processamento de amostras. A reprodutibilidade e robustez são fatores muito importantes ao processar um grande número de amostras. Erros de pipetação podem levar à interpretação errada completa dos dados e aqui a plataforma robótica forneceu baixa variação entre amostras. Também o uso da plataforma robótica para cPILOT reduziu o tempo necessário para preparar amostras. Por exemplo, depois de desenvolver o método automatizado, foi necessário 2,5 h para processar 22 amostras em comparação com 7,5 h para cPILOT manual. Experimentos estão em andamento em nosso laboratório para avaliar ainda mais as comparações dos fluxos de trabalho cPILOT manuais e automatizados. Com base em relatórios anteriores do nosso laboratório, os CV%’s de intensidades de íons de repórter de proteína no cPILOT manual foram, em média, 20% com alguns outliers excedendo esse valor12.
cPILOT é uma estratégia de derivação química no nível do peptídeo, que pode ser usada para qualquer tipo de amostra, como células, tecidos e fluidos corporais. o cPILOT oferece multiplexing de amostra aprimorado e com a incorporação da automação pode facilitar o multiplexing de amostra de alto rendimento em proteômica. Esse rendimento é necessário para avançar ainda mais a compreensão biológica e a descoberta de biomarcadores.
The authors have nothing to disclose.
Os autores reconhecem os Fundos de Start-up da Universidade Vanderbilt e o prêmio NIH (R01GM117191) ao RASR.
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
Tris | Biorad | 161-0716 | |
Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
Urea | Biorad | 161-0731 | |
Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |