여기서 제시된 프로토콜은 항체 특이성을 시험하기 위해 성인 꿀벌 뇌에서 단백질의 생산을 감소시키기 위한 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하는 프로토콜이다.
클러스터 정기적으로 간격이 짧은 Palindromic 반복 (CRISPR)/CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9)는 유전자 기능의 연구에서 널리 사용되는 유전자 편집 기술이다. 우리는 곤충 GABAA 수용체 소단위 저항디엘드린 (RDL) 및 대사성 글루타메이트 수용체 mGlutR1 (mGluRA)에 대하여 개발된 항체의 특이성을 확인하기 위하여 이 연구 결과에서 이 방법을 이용합니다. 항체는 열매파리(Drosophila melanogaster)뿐만아니라꿀벌(Apis mellifera)에특이적인 공액 펩티드에 대하여 토끼에서 발생하였다. 우리는 꿀벌 두뇌에 있는 수용체의 분포를 공부하기 위하여 꿀벌 두뇌 단면도에 있는 이 항체를 이용했습니다. 상기 항체는 펩티드에 대해 화결하고 면역블로팅 및 펩타이드 접합체를 이용한 퍼즈소어레이션의 고전적 방법으로 시험하여 항체가 제기된 해당 펩티드 접합체에 특이적임을 보여주었다. 여기에서 우리는 상응하는 수용체를 위해 디자인된 가이드 RNA를 가진 CRISPR-Cas9 주입 후에 두뇌에 있는 단백질 표적의 감소를 시험하기 위하여 CRISPR-Cas9 기술을 개발했습니다. CRISPR-Cas9 방법은 또한 하나 또는 다중 유전자가 수정될 필요가 있을 때 성인 꿀벌에 있는 행동 분석에서 이용될 수 있습니다.
최근에 발견된 CRISPR/Cas9 시스템은 다양한 모델 시스템과 유기체에서 게놈 DNA를 변경하는 데 사용된 강력한 도구입니다. 그것은 이전 방법 보다 더 효율적이 고 강력한 게놈 수정을 함으로써 생물 의학 연구 및 주요 기술 돌파구를 가속화했다 1. S. pyogenes 박테리아가 원산지인 이 시스템은 Cas9 엔도뉴렐라제에 의존하며, 그 활성은 DNA에서 이중 가닥 휴식(DSBs)을 초래하고, Cas9 단백질을 특정 서열 의존적 위치로 지시하는 가이드 RNA(gRNA)에 의존합니다2. CRISPR/Cas9에 의해 생성된 이중 가닥 브레이크는 비상동성 최종 결합(NHEJ)을 통해 복구할 수 있으며, 이는 프레임 이동으로 이어질 수 있는 오류가 발생하기 쉬운 프로세스또는 기증자 템플릿이 있을 때 상동성 직접 수리로 이어질 수 있습니다. gRNA 자체는 표적 특이적 CRISPR RNA(crRNA)와 리보뉴클레오단백질 복합체(RNP)2,3으로서정제된 Cas9 뉴클레아제와 함께 화학적으로 합성및 전달될 수 있는 보편적 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)로 구성된다. gRNA 또는 Cas9 뉴클레아제의 형광 표지는 형광 현미경 검사법을 통해 분자 성분의 검출 및 세포내 시각화를 허용할 수있습니다 4.
현재 의 작품에서, 우리는 성인 꿀벌 두뇌의 단백질 수준을 줄이기 위해 CRISPR-Cas9 시스템을 활용합니다. 우리는 대사성 글루타메이트 수용체 (mGluR) 및 항 mGlutR1 수용체 항체 및 GABAA 수용체 소단위 RDL 및 항 RDL 항체를 연구했습니다. 우리는 성인 꿀벌의 두뇌에 있는 단백질의 양을 감소시키는 간단한 방법을 개발하고 대응하는 단백질에 대하여 개발된 항체의 추가 시험을 몰기 위하여 그것을 이용했습니다. CRISPR-Cas9의 형광을 모니터링하여 단백질 감소에 관여하는 영역과 세포를 추정할 수 있었습니다.
이 방법을 사용하여, 우리는 또한 공액 펩티드에 대하여 토끼에서 만들어진 항 mGlutR1 항체를 특징으로 하였다. 꿀벌 게놈은 고도로 보존된 AmGluRA (NCBI 명명선에 따라 명명된 mGlutR1) 메타보트로픽 글루타메이트 수용체5를인코딩합니다. 꿀벌 mGlutR1 유전자는 NCBI 데이터베이스에 따라 4개의 예측된 스플라이스 변이체를 가지고 있습니다. 그것은 pupal 및 성인 꿀벌 단계 둘 다의 중추 신경계 (CNS)에서 표현되고 장기 기억 형성에 관여한다는 것을 보고되었습니다5. mGlutR1에 대해 개발된 항체는 꿀벌의 학습 및 기억 과정에서 글루타마테르기 시스템을 연구하는 데 필수적인 도구가 될 수 있습니다.
우리의 연구에서, 우리는 또한 아피스 mellifera RDL 수용체 소단위에서 공액 펩티드로 면역 토끼에서 개발 된 항 RDL 항체를 특징으로. 꿀벌 Rdl 유전자, AmRdl (XM_006565102.3, NCBI 데이터베이스), 14 예측 스플라이스 변이체가 있습니다. 부분적으로 복제된 조각은 NCBI 데이터베이스 AF094822.1에 보고되었습니다. RDL 수용체 기능 및 그 생리학은꿀벌9,10,11을포함하여 곤충6,7,8에서잘 연구된다. 항 RDL에 대하여 개발된 항체는 꿀벌에 있는 학습 그리고 기억 프로세스에 있는 GABAergic 시스템을 공부하기 위한 필수적인 공구일 수 있습니다.
옥토파민과 티라민 수용체의 역할에 대한 이전 연구는 서양 얼룩12,13에의한 단백질의 양을 후속 테스트로 뇌에 주입 RNAi를 사용했다. 그러나 RNAi에는 몇 가지 중요한 제한이 있습니다. 단백질의 감소가 발생하는 RNAi 주입 후 짧은 시간 창이있다 13. CRISPR-Cas9는 최근 꿀벌 배아에서 전체 동물14,15,16에서유전자를 삭제 또는 수정하는 데 사용되었다. 우리는 성인 꿀벌에 있는 단백질의 양을 감소시키기 위하여 CRISPR-Cas9의 사용을 보고했습니다. 우리는 통제된 실험실 조건 하에서 학습과 기억의 행동 연구 결과에 그것을 결합하는 기능 때문에 꿀벌을 위한 이 접근을개발했습니다 17.
본 작품에서, 우리는 2개의 수용체에 대하여 항체를 개발하고 단백질이 CRISPR-Cas9 주입에 의해 감소된 후에 성숙한 꿀벌 두뇌 단면도에 그(것)들을 시험했습니다. 동시에, 우리는 행동 실험에 대한 방법을 사용할 수있는 실험 디자인을 설립했다.
안티 RDL 및 안티 mGlutR1의 특성화
첫째, 우리는 고정 된 꿀벌 뇌의 조각에 면역 블롯 및 사전 흡착에 의한 항 RDL 및 항 mGlutR1 항체를 특징으로합니다. 각 항체는 모든 알려진 이소폼을 인식하도록 만들어졌으며, 서양 분석은 예측된 분자량에 해당하는 밴드를 인식한다는 것을 보여줍니다. 다음으로, 두 항체는 꿀벌 뇌 섹션에서 생산된 공액 펩티드에 의해 차단되었다.
우리의 연구 결과에 있는 첫번째 목표의 한개는 특정 공액 펩티드에 대하여 생성된 항체가 고정된 두뇌 조직에 있는 그것의 단백질에 특정하다는 것을 설치하는 것이었습니다. 이를 위해 CRISPR-Cas9 시스템을 활용했습니다. 우리는 꿀벌 RDL 및 mGlutR1에 대한 특정 가이드를 설계하고 형광 프로브 ATTO550로 라벨CRISPR-Cas9를 만들기 위해 각각을 사용했다. 각 수용체에 대해, 우리는 우리가 디자인한 Cas9 시스템을 취한 세포에 있는 대응하는 유전자를 제거해서 성숙한 꿀벌 두뇌에 있는 표적으로 한 단백질의 양을 감소시키기 위하여 오셀리에 있는 3개의 다른 CRISPR-Cas9 리보뉴클레오 단백질의 혼합물을 주입했습니다. 우리의 연구에서, 우리는이 단계를 달성.
이러한 실험의 성공을 위한 첫 번째 중요한 단계 중 하나는 적절한 가이드 RNA를 설계하는 것입니다. 유전자 서열의 시작, 중간 및 끝에 위치한 최대 5개의 가이드 RNA를 설계하는 것이 좋습니다. 우리의 예비 작업에서, 우리는 3 ~ 5 마리의 꿀벌에 다양한 조합으로 테스트했습니다. 우리는 또한 주사의 다른 농도 시도, 뿐만 아니라 주사 후 시간, 그리고 주사에 RNP의 다양 한 혼합물. 우리는 두뇌를 해부하고 반대로 RDL 및 반대로 mGlutR1 항체를 사용하여 가공했습니다. 이러한 초기 테스트에서, 우리는 적절 한 조합을 설립, 주입 후 시간, 농도 및 주입에 대 한 CRISPR-Cas9의 양 뿐만 아니라. 이러한 초기 테스트는 여기에서 자세히 설명한 실험을 설정하기 위한 기초가 되었습니다.
목표는 두 배였다: 1) 우리의 항체 염색은 CRISPR-Cas9 및 2) 행동 연구를위한 최상의 실험 조건을 통해 작동하도록 치료 후 감소 된 꿀벌에서 입증. 따라서, 많은 세포 핵이 주사 후 CRISPR-Cas9 48 h를 함유하는 경우, 안티-RDL 및 안티-mGlutR1 염색의 감소가 중요하다는 것을 보여준다. 추가적으로, 시험된 항체가 꿀벌 두뇌 준비에 있는 mGlut1 그리고 RDL 단백질을 구체적으로 인식하고 꿀벌 두뇌에 있는 현지화 연구 결과에서 사용될 수 있다는 것을 보여줍니다.
행동 연구를 위한 실험 설정 CRISPR-Cas9
다음으로, 우리는 CRISPR-Cas9가 행동 연구에 사용될 수 있도록 실험을 설정했습니다. 8개 또는 9마리의 꿀벌을 대조군 및 실험적 치료를 위해 수집하였다. 그(것)들은 주입 전후에 행동으로 시험되고, 그 후에 그들의 두뇌는 표적 단백질의 감소를 보인 두뇌 지구를 결정하기 위하여 ATTO550 및/또는 면역세포화학을 위해 가공되었습니다. 여기서 한 세트의 실험에 대해 취한 꿀벌의 수는 대조군 및 실험 조건에 대해 8-9 개 이하의 꿀벌로 제한되었다는 점에 유의해야합니다. 이 방법으로 두 조건을 같은 날에 테스트할 수 있습니다. 또한, 일단 우리가 주사에 대 한 CRISPR-Cas9 혼합물을 준비, 우리는 결코 그들을 동결. CRISPR-Cas9 혼합물은 3일 연속으로 사용했을 때 효능이 변하지 않았고 4-8°C에서 보관하였다. 그러나, 우리는 3 일 후에 그것을 시험하지 않았습니다.
실험 주사의 두 세트와 두 항체 모두에 대한 결과 섹션에서 설명했듯이, 테스트된 16개 꿀벌 중 3개만이 버섯 체체, 프로토세레브룸 및 안테나 로브에서 큰 분포ATTO550을 보였다. 다른 모든 꿀벌에서, CRISPR-Cas9의 분포는 버섯 몸, 중앙 복합체 및/또는 후방 프로토세레브럼으로 제한되었습니다. 이 주입 방법을 사용 하 여 대상 단백질의 감소 꿀벌의 대부분에 버섯 시체에만 제한 됩니다 어떤 행동 연구에 대 한 이해 하는 것이 필수적이다. 그것은 안테나 로브 또는 식도 신경절로 확장되지 않습니다. 따라서, 우리가 사용하는 주입 기술은 행동 실험에서 버섯 체내 및 중앙 복합체의 수용체 감소의 효과를 연구하는 데 적합하며, CRISPR-Cas9를 도입하는 다른 방법은 다른 뇌 영역을 연구하는 데 더 적합할 것입니다.
결론적으로, 우리의 연구는 뇌의 항체 염색을 위한 대조군으로 CRISPR-Cas9의 성공적인 적용을 입증했습니다. 항체(anti-RDL 및 anti-mGlutR1)의 경우, mGlutR1-CRISPR-Cas9 또는 RDL-CRISPR-Cas9의 섭취가 성공했을 때, 상응하는 항체 염색의 수준도 현저히 감소되었다. 또한, 오켈리에 주입 균질 하지 않은 뇌에서 CRISPR-Cas9의 분포를 주도 하는 주의 하는 것이 필수적이다. 분포는 오켈리와 버섯 몸을 둘러싼 최소한의 영역에서 전체 뇌의 많은 세포에 다양. 세포에 의한 mGlutR1-또는 RDL-CRISPR-Cas9 의 가변성은 주사의 변화에 기인할 가능성이 높았다. 우리의 데이터는 CRISPR-Cas9 시스템이 꿀벌에서 작동한다는 것을 보여줍니다, 그러나 주입의 방법은 개별 꿀벌 두뇌에 걸쳐 CRISPR-Cas9 섭취량의 가변성을 감소시키기 위하여 향상될 필요가 있습니다. 이러한 제한 내에서, 행동 실험을 위한 성인 꿀벌에 있는 유전자를 조작하기 위하여 이 기술을 채택하는 것이 지금 가능합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 BHS에 다음과 같은 상에 의해 지원되었다: 인간 국경 과학 프로그램; NIH NIGMS (R01 GM113967); NSF 아이디어 랩 (1556337). DmGluRA에 대한 펩티드 및 항체는 DR. Serge Birman (마르세유, 루미니, 프랑스) 연구소에서 설계되었다 때 IS는 프로그램 d’Urgence FRM / Postdocs UFP20060306548 에 의해 지원되었다 라 Recherche 의료를 부어. 우리는 RDL 가이드와 qPCR 드롭 오프 어세의 설계에 대한 도움을 통합 DNA 기술 (IDT)에서 다니엘라 Junqueira 마로시와 알렉스 한터에 감사드립니다.
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283_100 mL | western blotting |
Acrylamide-bis Acrylamide | Bio-Rad | 500 mL 1610156 | western blotting |
Agarose | Sigma-Aldrich | A0169-250g | used with distilled water to fix honey bee brain in blocks |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Research Laboratories | 711-546-152 | secondary antibody to reveal the primary antibodies from rabbit |
Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO | IDT | 1075934 | with desinged guide RNA, it creates gRNA |
Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3 | IDT | 1081058 | enzyme used to make ribonucleoprotein for CRISPR system |
Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 10 g 1610700 | western blotting |
Anti-mGlutR1 antibodies | Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of mGlut 1 in honey bees |
Anti-RDL antibodies | 21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of RDL in honey bees |
Aprotinin | Sigma-Aldrich | Y0001154 | protease inhibitor |
Barraquer Iris Scissors 7mm Blade Sharp point | World Precision Instruments | 14128-G | used for dissection honey bee brain |
Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | protease inhibitor |
Blade (breakable) for blade holder | Fine Science Tool | 10050-00 | dissection for western blotting |
Blade holder and breaker | Fine Science Tool | 15309 | dissection for western blotting |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100 F | for injection procedure |
Chemiluminescent western blot detection substrate | Bio-Rad | 1705062 | western blotting |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 472476-50mL | RNA isolation |
Dithiothreitol | Bio-Rad | 1610611 | western blotting |
DNA easy kit | QIAGEN | 69504 | DNA extractionuj |
DNA-free kit | INVITROGEN | AM1907 | Used to remove DNA |
Eppendorf Research plus pipette, 3-pack | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
Falcon 24 Well Polystyrene Multiwell | Falcon | 351147 | Multiwell |
Flat Bottom Embedding Capsules, Polyethylene | Electron Microscopy Science | 70021 | basket for brain sections |
Forceps Dumont #5 (pair) | Fine Science Tool | 11254-20 | for dissection of honey bee brain from the head |
Forceps Dumont #5S (pair) | Fine Science Tool | 11252-00 | to clean up the brain from trachea befor dissection |
Gene Expression Master Mix | Integrated DNA Technologies | 1055770 | qPCR drop off assay |
Glutaraldehyde | EMS | 16220 | used for preparation of peptide conjugates for control peabsorption |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500 mL | western blotting, embedding media |
Glycine | Bio-Rad | 1610718 | western blotting |
Hydrophobic filtered nylonmesh | Spectrum Labs | 145910 | for bottom of basket for brain sections |
Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-50mL | RNA isolation |
Keyhole limpet hemocyanin | Sigma-Aldrich | H7017 | used for preparation of conjugates for control |
LSM800 cofocal microscope | Zeiss | ||
mGlu_Guide 1 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
mGlu_Guide 2 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
mGlu_Guide 3 | IDT | designed guide RNA for CRISPR. Target mGlutR1 genome sequences | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | western blotting |
96-well PCR microplate | Applied biosystem | 4346907 | qPCR drop off assay and qRT-PCR |
384-well PCR microplate | Sigma-Aldrich | Z374911 | qRT-PCR |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904_500mL | for injection procedure |
Model p87 Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Capillary Preparation | |
Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | for embedding solution |
Nanoliter 2000 | World Precision Instruments Nanoliter | Injection Apparatus | |
Normal Donkey Serum | Jackson Research Laboratories | AB_2337258 | blocking agent for immunocytochemistry |
Non-immune Goat Serum | Invitrogen | 50-062Z 100 mL | blocking agent for immunoblotting |
Nuclease-free buffer | IDT | 1072570 | Nuclease-free buffer that is used in the preparation of CRISPR-Cas9 injection |
Nuclease-free water | IDT | AM9337 | nuclease -free water that is used in preparation of CRISPR-Cas 9 system |
OrbitalShaker Mp4 | Genemate | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500 g | used with PBS to make fixative for bee brains |
Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626-250 mg | protease inhibitor |
Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | Used with Paraformaldehyde as fixative; buffer for antibodies |