Presentato qui è un protocollo per utilizzare il sistema CRISPR-Cas9 per ridurre la produzione di una proteina nel cervello delle api adulte per testare la specificità degli anticorpi.
Cluster Regolarmente Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) è una tecnica di editing genico ampiamente utilizzata negli studi sulla funzione genica. Usiamo questo metodo in questo studio per verificare la specificità degli anticorpi sviluppati contro l’insetto GABAA recettore Resistenza alla dieldrina (RDL) e un recettore del glutammato metabotropico mGlutR1 (mGluRA). Gli anticorpi sono stati generati nei conigli contro i peptidi coniugati specifici per i moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) e alle api melappe (Apis mellifera). Abbiamo usato questi anticorpi nelle sezioni del cervello delle api per studiare la distribuzione dei recettori nel cervello delle api. Gli anticorpi sono stati purificati contro il peptide e testati con immunoblotting e il metodo classico di preadsorption con peptidi coniugato per dimostrare che gli anticorpi sono specifici per il corrispondente peptide coniugati contro cui sono stati sollevati. Qui abbiamo sviluppato la tecnica CRISPR-Cas9 per testare la riduzione dei bersagli proteici nel cervello 48 h dopo l’iniezione CRISPR-Cas9 con RNA guida progettati per il recettore corrispondente. Il metodo CRISPR-Cas9 può essere utilizzato anche nelle analisi comportamentali nelle api adulte quando uno o più geni devono essere modificati.
Il sistema CRISPR/Cas9 recentemente scoperto è un potente strumento che è stato utilizzato per modificare il DNA genomico in vari sistemi modello e organismi. Ha accelerato la ricerca biomedica e importanti scoperte tecnologiche rendendo la modificazione del genoma più efficiente e robusta rispetto ai metodi precedenti1. Originario dei batteri S. pyogenes, il sistema si basa su un endonuclease Cas9, la cui attività porta a rotture a doppio filamento (DSB) nel DNA e a un RNA guida (gRNA) che indirizza la proteina Cas9 verso una posizione specifica dipendente dalla sequenza2. Le rotture a doppio filamento generate da CRISPR/Cas9 possono essere riparate tramite l’unione finale non omologa (NHEJ), un processo soggetto a errori che può portare a frameshift, o riparazione diretta omemologia quando è presente un modello di donatore. Il gRNA stesso è costituito da un RNA CRISPR (crRNA) specifico del bersaglio e da un crRNA transattivauniversale universale (tracrRNA) che può essere sintetizzato chimicamente e consegnato con nuclease Cas9 purificata come complesso di ribonucleoproteina (RNP)2,3. L’etichettatura fluorescente del gRNA o della nuclea leva di Cas9 può consentire il rilevamento e la visualizzazione intracellulare di componenti molecolari tramite microscopia fluorescente4.
Nel nostro lavoro attuale, approfittiamo del sistema CRISPR-Cas9 per ridurre i livelli proteici nel cervello delle api adulte. Abbiamo studiato il recettore del glutammato metabotropico (mGluR) e gli anticorpi recettorianti anti-mGlutR1 e la sottounità del recettore GABAA RDL e anticorpi anti-RDL. Abbiamo sviluppato un metodo semplice per ridurre la quantità di proteine nel cervello dell’ape adulta e l’abbiamo usata per guidare ulteriori test degli anticorpi sviluppati contro le proteine corrispondenti. Il monitoraggio della fluorescenza di CRISPR-Cas9 ci ha permesso di stimare le aree e le cellule coinvolte nella riduzione della proteina.
Utilizzando questo metodo, abbiamo anche caratterizzato gli anticorpi anti-mGlutR1 che sono stati fatti nei conigli contro il peptide coniugato. Il genoma delle api codifica un AmGluRA altamente conservato (chiamato mGlutR1 secondo la nomenclatura NCBI) il recettore del glutammato metabotropico5. Il gene honeybee mGlutR1 ha quattro varianti di giunzione previste secondo il database NCBI. È stato riferito che è espresso nel sistema nervoso centrale (CNS) di entrambi gli stadi pupali e adulti delle api ed è coinvolto nella formazione della memoria a lungo termine5. Gli anticorpi sviluppati contro mGlutR1 possono essere uno strumento essenziale per studiare il sistema glutamategico nel processo di apprendimento e memoria nelle api.
Nei nostri studi, abbiamo anche caratterizzato anticorpi anti-RDL sviluppati in conigli immunizzati con peptidi coniugati dalla sottounità recettore Apis mellifera RDL. Il gene delle api melfale Rdl, AmRdl (XM_006565102.3, database NCBI), ha 14 varianti di giunzione previste. Un frammento parzialmente clonato è stato segnalato nel database NCBI AF094822.1. La funzione del recettore RDL e la sua fisiologia è ben studiata negli insetti6,7,8, comprese le api9,10,11. Anticorpi sviluppati contro anti-RDL può essere uno strumento essenziale per studiare il sistema GABAergic nel processo di apprendimento e memoria nelle api.
Uno studio precedente sul ruolo dei recettori della poltopamina e della tiramina ha usato RNAi iniettato nel cervello con un successivo test della quantità di proteine da macchia occidentale12,13. Tuttavia, l’RNAi presenta alcune limitazioni significative. C’è solo un breve lasso di tempo dopo l’iniezione di RNAi all’interno della quale si verifica una riduzione della proteina13. CRISPR-Cas9 è stato utilizzato molto recentemente negli embrioni di api per cancellare o modificare i geni in tutto l’animale14,15,16. Abbiamo segnalato l’uso di CRISPR-Cas9 per ridurre la quantità di proteine nell’ape adulta. Abbiamo sviluppato questo approccio per le api a causa della capacità di accoppiarlo a studi comportamentali di apprendimento e memoria in condizioni di laboratorio controllate17.
Nel presente lavoro, abbiamo sviluppato anticorpi contro due recettori e li abbiamo testati sulle sezioni adulte del cervello delle api dopo che la proteina è stata ridotta con l’iniezione CRISPR-Cas9. Allo stesso tempo, abbiamo stabilito un progetto sperimentale che permette l’uso del metodo per esperimenti comportamentali.
Caratterizzazione dell’anti-RDL e dell’anti-mGlutR1
In primo luogo, abbiamo caratterizzato gli anticorpi anti-RDL e anti-mGlutR1 da immunoblot e pre-adsorbiente sulle fette di cervelli fissi delle api. Ogni anticorpo è stato fatto per riconoscere tutte le sue isoformi conosciute, e l’analisi occidentale mostra che riconoscono le bande che corrispondono ai loro pesi molecolari previsti. Successivamente, entrambi gli anticorpi sono stati bloccati dal peptide coniugato contro il quale sono stati prodotti su sezioni cerebrali di api melpote.
Uno dei primi obiettivi del nostro studio è stato quello di stabilire che gli anticorpi prodotti contro il peptide coniugato specifico sono specifici per la sua proteina nel tessuto cerebrale fisso. A tale scopo, abbiamo approfittato del sistema CRISPR-Cas9. Abbiamo progettato guide specifiche per honeybee RDL e mGlutR1 e le abbiamo utilizzate per realizzare CRISPR-Cas9 etichettato con la sonda fluorescente ATTO550. Per ogni recettore, abbiamo iniettato una miscela di tre diverse ribonucleoproteine CRISPR-Cas9 negli ocelli per ridurre la quantità di proteine mirate nel cervello delle api adulte eliminando il gene corrispondente nelle cellule che hanno assunto il nostro sistema Cas9 progettato. Nel nostro studio, abbiamo compiuto questo passaggio.
Uno dei primi passi cruciali per il successo di questi esperimenti è la progettazione degli RNA guida appropriati. Si consiglia di progettare fino a cinque RNA guida, situati all’inizio, al centro e alla fine della sequenza genica. Nel nostro lavoro preliminare, li abbiamo testati in varie combinazioni su tre o cinque api. Abbiamo anche provato diverse concentrazioni di iniezioni, così come i tempi dopo l’iniezione, e varie miscele di RNP nelle iniezioni. Abbiamo sezionato i cervelli e li abbiamo elaborati usando anticorpi anti-RDL e anti-mGlutR1. In questi test iniziali, abbiamo stabilito la combinazione appropriata, il tempo di post-iniezione, così come la concentrazione e la quantità di CRISPR-Cas9 per l’iniezione. Questi test iniziali sono stati la base per la creazione degli esperimenti che abbiamo descritto in dettaglio qui.
L’obiettivo era duplice: 1) dimostrare in un’ape che la nostra colorazione anticorpale è stata ridotta dopo il trattamento con CRISPR-Cas9 e 2) per lavorare attraverso le migliori condizioni sperimentali per gli studi comportamentali. Così, mostriamo che se molti nuclei cellulari contengono CRISPR-Cas9 48 h dopo l’iniezione, la riduzione della colorazione anti-RDL e anti-mGlutR1 è significativa. Inoltre, questo dimostra che gli anticorpi testati riconoscono specificamente la proteina mGlut1 e RDL nella preparazione del cervello delle api melfale e che possono essere utilizzati per studi di localizzazione nel cervello delle api.
Impostazione sperimentale CRISPR-Cas9 per lo studio comportamentale
Successivamente, abbiamo impostato gli esperimenti in modo che CRISPR-Cas9 potrebbe essere utilizzato in studi comportamentali. Sono state raccolte otto o nove api melpote per il controllo e i trattamenti sperimentali. Sono stati testati comportamentalmente prima e dopo l’iniezione, e poi i loro cervelli sono stati elaborati per ATTO550 e/o immunocitochimica per determinare le regioni cerebrali che hanno mostrato la riduzione della proteina bersaglio. Qui è essenziale notare che il numero di api prese per una serie di esperimenti è stato limitato a non più di 8-9 api per le condizioni di controllo e sperimentali. In questo modo entrambe le condizioni potrebbero essere testate lo stesso giorno. Inoltre, una volta preparate le miscele CRISPR-Cas9 per l’iniezione, non le abbiamo mai congelate. La miscela CRISPR-Cas9 non ha cambiato la potenza quando viene utilizzata 3 giorni di fila e mantenuta a 4-8 gradi centigradi. Tuttavia, non abbiamo provato dopo 3 giorni.
Come abbiamo descritto nella sezione Risultati per entrambi i set di iniezioni sperimentali e per entrambi gli anticorpi, solo tre api da 16 testate hanno mostrato una grande distribuzione ATTO550 nel corpo del fungo, nel protocerebrum e nei lobi delle antenne. In tutte le altre api, la distribuzione di CRISPR-Cas9 era limitata al corpo del fungo, al complesso centrale e/o al protocerere posteriore. È essenziale capire per qualsiasi studio comportamentale che utilizzando questo metodo di iniezione la riduzione della proteina bersaglio sarà limitata solo al corpo del fungo nella maggior parte delle api. Non si estenderà al lobo dell’antenna o al ganglio subesofageo. Così, la tecnica di iniezione che usiamo è adatta per studiare l’effetto della riduzione dei recettori nel corpo del fungo e complesso centrale in esperimenti comportamentali, mentre un metodo diverso di introduzione CRISPR-Cas9 sarà più appropriato per studiare altre regioni del cervello.
In conclusione, il nostro studio ha dimostrato il successo dell’applicazione di CRISPR-Cas9 come controllo per la colorazione degli anticorpi nel cervello. Per entrambi gli anticorpi (anti-RDL e anti-mGlutR1), quando l’assorbimento di mGlutR1-CRISPR-Cas9 o RDL-CRISPR-Cas9 ha avuto successo, anche il livello di colorazione degli anticorpi corrispondenti è stato ridotto in modo significativo. Inoltre, è essenziale notare che l’iniezione negli ocelli ha portato ad una distribuzione di CRISPR-Cas9 nel cervello che non era omogeneo. La distribuzione variava da un’area minima che circonda il corpo di ocelli e funghi a molte cellule in tutto il cervello. La variabilità dell’assorbimento mGlutR1-o RDL-CRISPR-Cas9 da parte delle cellule era probabilmente dovuta a variazioni nelle iniezioni. I nostri dati mostrano che il sistema CRISPR-Cas9 funziona nelle api, ma il metodo di iniezione deve essere migliorato per ridurre la variabilità dell’assorbimento di CRISPR-Cas9 nei singoli cervelli delle api. All’interno di queste restrizioni, è ora possibile impiegare questa tecnica per manipolare i geni nelle api adulte per esperimenti comportamentali.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dai seguenti premi a BHS: Human Frontiers Science Program; NIH NIGMS (R01 GM113967); Laboratorio di idee NSF (1556337). Il peptide e anticorpi per DmGluRA sono stati progettati nel laboratorio Dr. Serge Birman (Marsiglia, Luminy, Francia) quando IS è stato supportato dal Programma d’Urgence FRM/Postdocs UFP20060306548 dalla Fondation pour la Recherche Medicale. Siamo grati per Daniela Junqueira Marosi e Alex Hanter di Integrated DNA Technology (IDT) per la progettazione di guide RDL e analisi di drop-off qPCR.
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283_100 mL | western blotting |
Acrylamide-bis Acrylamide | Bio-Rad | 500 mL 1610156 | western blotting |
Agarose | Sigma-Aldrich | A0169-250g | used with distilled water to fix honey bee brain in blocks |
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Research Laboratories | 711-546-152 | secondary antibody to reveal the primary antibodies from rabbit |
Alt-R CRISPR-cas9 tracrRNA-5'ATTO | IDT | 1075934 | with desinged guide RNA, it creates gRNA |
Alt-R S.p. Cas9 nuclease V3 | IDT | 1081058 | enzyme used to make ribonucleoprotein for CRISPR system |
Ammonium Persulfate | Bio-RAD | 10 g 1610700 | western blotting |
Anti-mGlutR1 antibodies | Covalab (FRANCE)/21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of mGlut 1 in honey bees |
Anti-RDL antibodies | 21st Century Biochemical | characterized by authors in present paper | Used for primary incubation of RDL in honey bees |
Aprotinin | Sigma-Aldrich | Y0001154 | protease inhibitor |
Barraquer Iris Scissors 7mm Blade Sharp point | World Precision Instruments | 14128-G | used for dissection honey bee brain |
Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | protease inhibitor |
Blade (breakable) for blade holder | Fine Science Tool | 10050-00 | dissection for western blotting |
Blade holder and breaker | Fine Science Tool | 15309 | dissection for western blotting |
Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100 F | for injection procedure |
Chemiluminescent western blot detection substrate | Bio-Rad | 1705062 | western blotting |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 472476-50mL | RNA isolation |
Dithiothreitol | Bio-Rad | 1610611 | western blotting |
DNA easy kit | QIAGEN | 69504 | DNA extractionuj |
DNA-free kit | INVITROGEN | AM1907 | Used to remove DNA |
Eppendorf Research plus pipette, 3-pack | Sigma-Aldrich | Z683884 | |
Falcon 24 Well Polystyrene Multiwell | Falcon | 351147 | Multiwell |
Flat Bottom Embedding Capsules, Polyethylene | Electron Microscopy Science | 70021 | basket for brain sections |
Forceps Dumont #5 (pair) | Fine Science Tool | 11254-20 | for dissection of honey bee brain from the head |
Forceps Dumont #5S (pair) | Fine Science Tool | 11252-00 | to clean up the brain from trachea befor dissection |
Gene Expression Master Mix | Integrated DNA Technologies | 1055770 | qPCR drop off assay |
Glutaraldehyde | EMS | 16220 | used for preparation of peptide conjugates for control peabsorption |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500 mL | western blotting, embedding media |
Glycine | Bio-Rad | 1610718 | western blotting |
Hydrophobic filtered nylonmesh | Spectrum Labs | 145910 | for bottom of basket for brain sections |
Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-50mL | RNA isolation |
Keyhole limpet hemocyanin | Sigma-Aldrich | H7017 | used for preparation of conjugates for control |
LSM800 cofocal microscope | Zeiss | ||
mGlu_Guide 1 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
mGlu_Guide 2 | IDT | designed guide RNA for CRISPR-Cas 9. Target mGlutR1 genome sequences | |
mGlu_Guide 3 | IDT | designed guide RNA for CRISPR. Target mGlutR1 genome sequences | |
methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | western blotting |
96-well PCR microplate | Applied biosystem | 4346907 | qPCR drop off assay and qRT-PCR |
384-well PCR microplate | Sigma-Aldrich | Z374911 | qRT-PCR |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904_500mL | for injection procedure |
Model p87 Flaming Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | Capillary Preparation | |
Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | for embedding solution |
Nanoliter 2000 | World Precision Instruments Nanoliter | Injection Apparatus | |
Normal Donkey Serum | Jackson Research Laboratories | AB_2337258 | blocking agent for immunocytochemistry |
Non-immune Goat Serum | Invitrogen | 50-062Z 100 mL | blocking agent for immunoblotting |
Nuclease-free buffer | IDT | 1072570 | Nuclease-free buffer that is used in the preparation of CRISPR-Cas9 injection |
Nuclease-free water | IDT | AM9337 | nuclease -free water that is used in preparation of CRISPR-Cas 9 system |
OrbitalShaker Mp4 | Genemate | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500 g | used with PBS to make fixative for bee brains |
Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626-250 mg | protease inhibitor |
Phosphate Buffer Saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | Used with Paraformaldehyde as fixative; buffer for antibodies |